线粒体自噬在阿霉素心脏毒性中的研究进展*

周 云，王玲娥，余 薇，查文良**

(1.湖北科技学院临床医学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院药学院)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种从链霉菌中提取出的蒽环类抗生素，被广泛用于治疗白血病、实体肿瘤、软组织肉瘤和乳腺癌等多种癌症[1]。然而，当机体内阿霉素的累积剂量超过其治疗安全阈值时，心脏的结构和功能会受到严重损伤，表现为心律失常、心肌病、左室功能障碍与充血性心力衰竭等一系列病理改变，致使阿霉素在临床应用上受到严重限制[2-3]。研究发现[4]，阿霉素诱导的心肌损伤涉及多种机制，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生、脂质过氧化和线粒体功能障碍等，其中线粒体功能障碍被认为是阿霉素诱导心脏毒性发生的关键，因此，其调控途径可作为防治阿霉素心脏毒性的一个新的潜在靶点。

1 线粒体自噬

线粒体作为真核细胞的动力来源，主要负责调节三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)产生和细胞能量代谢的关键细胞器。同时也作为ROS的主要来源，其产生的ROS可氧化线粒体内外的蛋白质、脂质以及核酸，引起细胞内线粒体结构损伤和功能紊乱，最终导致细胞损伤甚至死亡。

线粒体自噬作为一种选择性的自噬，一直被认为是负责调控线粒体质量的潜在机制，主要通过自噬体形成以及自噬体和溶酶体融合的方式选择性清除细胞内结构损伤和功能障碍的线粒体或降解不必要的正常的线粒体，防止ROS等有害产物的积累，同时保证线粒体的正常功能，对满足细胞能量需求和维持细胞内环境平衡具有关键作用。值得注意的是，功能失调的，主要是有缺陷的线粒体自噬参与各种人类疾病的病理生理进程，包括心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、自身免疫性疾病和衰老等[5]。因此，线粒体自噬的分子机制和功能研究备受关注。目前，研究发现线粒体自噬的分子机制与酵母中的自噬相关蛋白32以及哺乳动物细胞中的线粒体分裂和融合相关蛋白、PTEN诱导性激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)、E3泛素连接酶Parkin、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3)、Nip3样蛋白X(NIP3-like protein X，NIX)、FUN14结构域包含蛋白1(FUN14 domain containing 1，FUNDC1)等密切相关[6-7]。例如，在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)中，磷酸酶张力蛋白同源物通过抑制线粒体自噬促进内皮细胞凋亡，同时高蛋白饮食导致过量氨基酸摄入，也会通过阻断NIX介导的线粒体自噬活性，加剧动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞凋亡和热下垂[8]。此外，在阿霉素诱导的心脏毒性中，阿霉素诱导线粒体自噬，表现为自噬小体、轻链3(light chain 3，LC3)、Beclin1增加、p62减少以及LC3在线粒体中的共定位，同时阿霉素激活PINK1/Parkin通路，促进PINK1/Parkin向线粒体转运[9]。因此，表明线粒体自噬与阿霉素诱导的心脏毒性密切相关，然而其确切的分子机制尚未完全阐明。

2 阿霉素诱导的心脏毒性中线粒体自噬的分子机制

在阿霉素诱导的心脏毒性中，阿霉素诱发的ROS超载和凋亡启动蛋白的释放与抑制受损或不必要线粒体的清除有关，通过线粒体自噬可确保阿霉素所致的受损或不必要线粒体的选择性清除。目前据文献报道[10-11]，阿霉素诱导的心脏毒性中线粒体自噬受线粒体分裂及融合相关蛋白和线粒体自噬受体PINK1/Parkin、BNIP3/NIX、FUNDC1等调控。特别是自噬受体，它们有一共同特征，即具有和LC3相互作用的LC3结合位点，从而促使线粒体被包裹进自噬囊泡中，诱导线粒体自噬的发生，清除受损或不必要的线粒体，最终维持线粒体结构和功能的稳定。

2.1 线粒体分裂及融合相关蛋白

线粒体分裂由线粒体外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)上的蛋白质、裂变蛋白1(fission protein 1，FIS1)、线粒体分裂因子、线粒体动力蛋白49/50以及动力相关蛋白1(dynamin related protein 1，DRP1)相互作用介导。线粒体融合由OMM上的线粒体融合蛋白1与线粒体融合蛋白2(mitofusin 2，MFN2)或MFN2与MFN2的二聚引发的OPA1介导。其中MFN2在PINK1的介导下磷酸化，并将融合蛋白转化为线粒体自噬受体，减少线粒体的融合，从而减轻细胞损伤。首次在阿霉素诱导的肝损伤中发现，线粒体分裂及融合和线粒体自噬机制的改变可防止阿霉素引起的肝毒性，而线粒体分裂可能作为一种自适应反应参与阿霉素介导的线粒体自噬的发生发展[12]。有研究发现[13]，在阿霉素诱导的心脏毒性中，尽管阿霉素降低了线粒体融合的初级调节因子OPA1的蛋白表达水平，但线粒体分裂的调节因子DRP1和FIS1的表达并没有变化，引起线粒体碎片增加、线粒体自噬激活，而DRP1敲除后线粒体碎片减少、心肌细胞线粒体自噬通量降低、阿霉素诱导的心脏损伤减轻，这些现象表明线粒体分裂及融合，尤其是依赖于DRP1的线粒体分裂在阿霉素诱导的线粒体自噬中是必不可少的。

2.2 PINK1和Parkin

目前，PINK1/Parkin途径介导的线粒体自噬是哺乳动物系统中研究最广泛的途径[14]。PINK1作用于Parkin的上游，是Parkin激活和募集去极化线粒体所必需的。在健康的线粒体中，PINK1作为线粒体靶向蛋白通过OMM定位的X线粒体外膜转位酶(translocase of outer mitochondrial membrane，TOM)复合物和线粒体内膜定位的线粒体内膜转位酶(translocase of inner mitochondrial membrane，TIM)复合物导入线粒体，并被早老素相关菱形样蛋白降解而维持在低水平。而在受损的线粒体中，线粒体的去极化及膜电位的耗散可抑制贯穿于TIM/TOM复合体的PINK1导入线粒体，PINK1在OMM上积累并稳定在一个由TOM7、TOM40、TOM70、TOM20和TOM22组成的复合物中，从而将Parkin从胞浆招募到泛素化OMM蛋白的线粒体，最终激活线粒体自噬[15]。有研究发现[16]，在阿霉素诱导的心脏毒性中，阿霉素引起线粒体损伤并破坏PINK1/Parkin依赖性的线粒体自噬，通过促进Parkin向线粒体的积累，激活Parkin介导的线粒体自噬以维持线粒体功能，最终改善阿霉素对心肌细胞的损伤。因此，可猜测PINK1/Parkin途径介导的线粒体自噬与阿霉素诱导的心脏毒性密切相关。

2.3 BNIP3和NIX

BNIP3是Bcl-2家族的成员，与DRP1和OPA1相关，促进线粒体分裂而抑制融合，同时BNIP3含有的LC3相互作用基序(LC3-interacting region，LIR)能够通过促进LC3的表达，降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性，独立影响线粒体自噬。NIX与BNIP3同源，是线粒体更新和程序性细胞死亡途径的双重调节因子，参与细胞内的线粒体自噬和细胞死亡。同时，NIX作为一种线粒体外膜蛋白，也含有定位于自噬体膜表面的LIR基序，可介导线粒体隔离进入自噬小泡，从而诱导线粒体自噬和清除损伤的线粒体。有研究发现[17]，在阿霉素诱导的心脏毒性模型中，BNIP3可转移到线粒体，促进通透性转变和去极化，诱导Parkin招募到线粒体，启动线粒体自噬。此外，在哺乳动物细胞中，BNIP3触发DRP1从胞浆向OMM转运并招募Parkin，从而激发线粒体自噬以清除受损线粒体。可见，BNIP3介导的线粒体自噬依赖于心肌细胞中的Parkin募集，参与阿霉素诱导的心脏毒性的发生及发展。

2.4 FUNDC1

FUNDC1作为缺氧条件下哺乳动物细胞中的一种线粒体外膜蛋白，与内质网-线粒体接触位点相互作用而被积累，通过LIR基序与自噬标记LC3结合发挥作用。在缺氧条件下，FUNDC1被SRC激酶和CK2在酪氨酸18和丝氨酸13的位点磷酸化时，降低了它对LC3的亲和力；而被PGAM5或其他尚待鉴定的磷酸酶去磷酸化时，很大程度上增加了它与LC3或其他自噬基因的相互作用，从而启动线粒体自噬[18]。迄今为止，仅研究过缺氧条件下诱导的线粒体自噬，而阿霉素对FUNDC1介导的线粒体自噬的作用仍有待确定[10]。不过，FUNDC1在线粒体分裂过程中也是DRP1的一个适配器，FUNDC1过表达可诱导线粒体分裂，而FUNDC1基因敲除则导致线粒体融合。

3 线粒体自噬在阿霉素心脏毒性中的作用

近年来，心脏组织中丰富的线粒体已被确定为阿霉素诱导心脏毒性发生的关键靶点之一[19]。目前，研究者通过大量体内外实验对线粒体自噬在阿霉素心脏毒性中的作用进行了研究。首先，在阿霉素诱导的心脏毒性的体外研究中，Xu等[20]研究发现，1μmol/L阿霉素诱导心肌细胞24h后，阿霉素可通过诱导转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)功能异常来抑制溶酶体功能，从而破坏心脏自噬，心脏自噬过程的中断导致ROS过量产生以及△ψm分离，最终使线粒体介导的细胞凋亡和死亡。说明缺陷的线粒体自噬在阿霉素诱导的心脏毒性中发挥损伤作用，而线粒体自噬的增加是降低细胞凋亡的有效手段，这也从反面证实了线粒体自噬可通过选择性清除受损的线粒体对心脏发挥保护作用。此外，小剂量阿霉素诱导的心脏毒性与DRP1磷酸化抑制、mTOR磷酸化升高以及TFEB的表达受到抑制有关，通过DRP1/mTOR/TFEB途径增加线粒体自噬可减轻阿霉素诱导的心脏毒性。大剂量阿霉素诱导的心脏毒性与细胞内的线粒体自噬增加有关，最终导致心功能发生障碍[10]。也有研究者发现[13]，DRP1抑制剂mdivi-1通过抑制线粒体分裂和线粒体自噬阻止了阿霉素的损伤作用。因此，上述研究表明线粒体自噬在阿霉素诱导的心脏毒性中发挥双重作用：缺陷或过度的线粒体自噬可加重心肌损伤，而适量的线粒体自噬可通过线粒体自噬-溶酶体蛋白降解系统清除损伤的线粒体减轻心脏损伤，这可能是由于阿霉素剂量的不同导致的。

有趣的是，也有研究者发现线粒体自噬在阿霉素诱导的体外实验中的双重作用除了与阿霉素剂量有关外，可能还与细胞品系和孵育时间有关。例如，Liang等[21]研究表明，5μmol/L阿霉阿霉素诱导新生小鼠心室肌细胞24h后，阿霉素促进线粒体和溶酶体的共定位，诱导线粒体自噬。他们发现，在阿霉素刺激下LRRK2和Rab7水平升高，TOM20和TIM23水平降低，用线粒体自噬抑制剂莲心碱处理后逆转了这一现象，其Rab7水平的降低抑制自噬小体和溶酶体融合以抑制阿霉素刺激心肌细胞的线粒体自噬，从而减轻阿霉素引起的心脏功能障碍。相比之下，Xiao等[19]研究发现，在2μmol/L阿霉阿霉素诱导H9C2细胞24h后，Parkin的蛋白和mRNA水平均降低，用构建的质粒高表达Parkin可减弱细胞凋亡；用Ad-RFP-GFP-LC3转染细胞发现，Parkin表达显著增加了自噬小体和自噬溶酶体数量；Parkin过表达导致LC3显著升高。他们认为Parkin过表达提高线粒体自噬可能保护了阿霉素诱导的心肌损伤。此外，Wang等[16]研究发现，1μmol/L阿霉阿霉素诱导新生大鼠心肌细胞12h后，透射电镜图像显示很少有自噬小体吞噬线粒体，同时线粒体中的Parkin、LC3Ⅱ和p62蛋白水平以及Parkin和p62与线粒体的共定位均降低，SESN2过表达增加它们的表达和共定位，激活Parkin依赖性线粒体自噬保护心肌细胞免受阿霉素诱导的损伤。

同样的，在阿霉素诱导的心脏毒性体内实验中线粒体自噬亦发挥双重作用。然而，线粒体自噬是一个动态过程，在阿霉素诱导的急性心脏毒性模型中并不仅是简单的激活或抑制线粒体自噬，也关系到线粒体自噬通量的整个过程。Liu等[11]实验发现，在阿霉素诱导的急性心脏毒性，阿霉素抑制Parkin的表达及其从胞浆到线粒体的易位，这损害了线粒体自噬，同时，阿霉素还破坏了线粒体自噬通量，而Rubicon缺失可改善阿霉素处理后心脏的线粒体自噬通量和线粒体自噬。相对的，在阿霉素诱导的慢性心脏毒性模型中，阿霉素处理后5d，Parkin/PINK1的表达水平降低，证明在这个时间点Parkin介导的线粒体自噬的吞噬功能降低；然而阿霉素处理后2周，这些蛋白的表达水平发生反弹，甚至超过对照组，同时线粒体分裂与线粒体自噬增加相关的FIS1蛋白的表达也增加[22]。因此，这些研究表明模型类型及处理时间的不同也可能是线粒体自噬双重作用的原因。

综上所述，线粒体自噬发生的“量”是保护或有助于阿霉素心脏毒性的关键。有文献报道[19]，线粒体自噬在阿霉素诱导的心脏毒性中发挥的不同作用可能还与用于测量线粒体自噬的方法不同有关。然而，尚无足够的实验研究证实。因此，在将来研究线粒体自噬在阿霉素心脏毒性中的作用及调控机制时，需考虑到上述这些因素的影响，这对于临床上防治阿霉素的心脏毒性有着重要的研究价值。

4 展 望

21世纪以来，阿霉素剂量依赖性和累积性诱发的不可逆的退行性心肌病和充血性心力衰竭等心脏毒副作用给患者带来了极大的不利影响。因此，及时监测和调节线粒体自噬水平、了解影响线粒体自噬“量”变化的因素及机制、掌控线粒体自噬发挥保护作用的“量”以及维持线粒体的内环境稳态等措施在防治阿霉素心脏毒性方面至关重要。目前，哺乳动物细胞中线粒体分裂及融合相关蛋白、PINK1/Parkin、BNIP3/Nix以及FUNDC1等分子途径，尤其是PINK1/Parkin途径相关的线粒体自噬作为选择性地清除细胞内结构损伤和功能障碍的线粒体或降解不必要的正常线粒体的一种方式，参与阿霉素心脏毒性的发生发展。然而，由于线粒体自噬在阿霉素心脏毒性中的作用及确切机制尚未完全阐明，故需针对线粒体自噬在阿霉素心脏毒性中的作用及机制做进一步研究，为临床上阿霉素心脏毒性的防治提供新的理论依据和靶点。