PCR荧光探针法检测4种生殖道病原体的结果分析

刘意,冯霞,李宇,魏虹娟，张立丽,何盼,娄金丽(首都医科大学附属北京佑安医院临检中心，北京 100069)

引起性传播疾病的主要病原体包括淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae, NG)、解脲脲原体(Ureaplasmaurelyticum，Uu)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis, CT)、单纯疱疹病毒-2型(herpes simplex virus,HSV-2)等[1]，虽引起疾病临床表现各不相同，但可造成男性尿道炎、附睾炎、前列腺炎等及女性宫颈炎、子宫内膜炎盆腔炎甚至流产等危害[2-3]，部分人群表现为无症状而被忽视，造成上行感染及并发症。选取灵敏度高、特异性强、快速、准确的检测方法可为治疗预案提供支持。现就首都医科大学附属北京佑安医院2021年1—8月采集的生殖道分泌物及血液样本，采用PCR荧光探针法、培养法、胶体金法、酶联法进行NG、Uu、CT及HSV-2抗体项目检测并对结果进行比较。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2021年1月—2021年8月首都医科大学附属北京佑安医院感染中心性病门诊就诊者1 738例。男性907例，年龄18～63岁，平均年龄37岁；女性831例，年龄16～59岁，平均年龄34岁。临床诊断主要为梅毒、尖锐湿疣、查体及疑似淋病、尿道炎、阴道炎、生殖器疱疹。共采集宫颈分泌物644例、阴道分泌物187例、尿道分泌物907例、血液标本227例。患者及家属均知情同意。

1.2标本采集 男性尿道拭子：采样前1～2 h不要排尿，使用无菌拭子伸入尿道2～4 cm处轻轻转动3～5 s，取出拭子放入无菌收集管中保存。女性宫颈拭子：采样前，使用棉球将宫颈外黏液拭去，使用阴道窥器暴露子宫颈口，用无菌棉拭子插入患者的子宫颈内口与鳞状上皮细胞交界处旋转15～20 s后取出，放入无菌收集管中保存。女性阴道拭子：避开月经期，使用无菌棉拭子采集阴道分泌物，将无菌棉拭子放入无菌收集管中保存。血液标本：用普通采血管采集。

1.3试剂及仪器 PCR荧光探针试剂盒(湖南圣湘公司)，NG、Uu(培养法)试剂盒(安图生物公司)，CT(胶体金法)试剂盒(上海凯创公司)，HSV-2型(酶联法)试剂(Trinity Biotech Plc公司)；7500荧光PCR仪(ABI公司)，全自动酶联仪(Tecan公司)，全自动生物质谱分析仪(BRUKER公司)。

1.4PCR荧光探针法 样本收集管中加入1 mL无菌生理盐水，棉拭子反复挤压，作为待测样本。按比例加入反应液及酶混合液备用，分别加入阴、阳性对照质控品及待测样本，加入核酸释放剂进行加样处理，瞬时离心后，按说明书规定仪器设定程序进行扩增。阳性判定标准为目标基因的Ct参考值为38，检测内标的Ct参考值为40。

1.5培养法

1.5.1NG培养 将采集的分泌物标本立即分区接种巧克力培养基中，将平皿放置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养48 h。阳性判定标准：经48 h培养后如有湿润、光滑、水滴样半透明菌落，挑取菌落加入基质液中，将样品板放入全自动生物质谱分析仪中进行检测，按照数据库图谱鉴定结果。

1.5.2Uu培养 按试剂盒说明书进行操作。阳性判定标准：因分解尿素使指示剂变色，若指示剂由黄转红，判为阳性。

1.5.3CT检测(胶体金法) 向样品处理管中加入6滴溶液A，采集的分泌物标本加入处理管中不断旋转并在管壁挤压拭子，使液体不断被挤出，重复2 min。加入6滴溶液B，旋转并挤压拭子，尽量使液体流出，然后按感染物品的处理方法将拭子丢弃，将样品处理管中已处理的样品滴加2～3滴至检测试剂盒的加样孔中，在15 min后判断结果。阳性判定标准为除质控线外，在检测线出现红线。

1.5.4HSV-2型抗体检测(酶联法) 将采集后血液样本离心后放至加样架，将试剂分别放至固定位置，按照全自动酶联仪工作站编制检测程序进行检测。阳性判定标准为cut-off值=校准品平均吸光度值×校正因子，ISR值=患者血清样本吸光度值/cut-off值，ISR值≥1.10为阳性。

1.6统计学分析 用SPSS 24.0软件进行。率的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同方法检测Uu结果比较 478例用PCR荧光探针与培养法共同检测Uu，其中，男性176例，女性302例。PCR荧光探针法检测阳性率38.7%(185/478)，培养法阳性率39.96%(191/478)，两者间差异无统计学意义(χ2=0.16，P>0.05), 两种方法符合率91.21%(436/478)，阳性符合率87.43%(167/191)，阴性符合率93.73%(269/287)。见表1。

表1 PCR荧光探针法和液体培养法结果比较

2.2不同方法检测CT结果比较 654例用PCR荧光探针与胶体金法共同检测CT，其中，男性369例，女性285例。PCR荧光探针法检测阳性率7.34%(48/654)，胶体金法阳性率3.21%(21/654)，两者间差异有统计学意义(χ2=11.15，P<0.001), 两种方法符合率95.26%(623/654)，阳性符合率90.48%(19/21)，阴性符合率95.42%(604/633)。见表2。

表2 PCR荧光探针法和胶体金法结果比较

2.3不同方法检测NG结果比较 379例用PCR荧光探针与培养法共同检测NG，其中，男性274例，女性105例。PCR荧光探针法检测阳性率9.50%(36/379)，培养法阳性率7.65%(29/379)，两者间差异无统计学意义(χ2=0.83，P>0.05), 两种方法符合率98.15%(372/379)，阳性符合率100%(29/29)，阴性符合率98%(343/350)。见表3。

表3 PCR荧光探针法和培养法结果比较

2.4不同方法检测HSV-2型结果比较 227例用PCR荧光探针与酶联法共同检测HSV-2型，其中，男性91例，女性136例。PCR荧光探针法检测阳性率3.52%(8/227)，酶联法阳性率10.57%(24/227)，两者间差异有统计学意义(χ2=8.61，P<0.05), 两种方法符合率92.51%(210/227)，阳性符合率33.33%(8/24)，阴性符合率99.51%(202/203)。见表4。

表4 PCR荧光探针法和酶联法结果比较

3 讨论

本次PCR荧光探针和培养法检测Uu、NG结果差异无统计学意义。PCR荧光探针法检测Uu的检出率与培养法相近(38.7%、39.96%)，与王勤婉等[3]研究一致。24例PCR荧光探针法阴性、培养法阳性的样本中，3例培养出人型支原体。经分析，同样能分解尿素的还有微小支原体(Up)，Up也是引发支原体感染的一种病原体，因无法将Uu和Up区分开[4]，因此推测培养法检测的有可能是Uu和Up两种总的脲原体，并且有少数杂菌也可造成假阳性。而PCR荧光探针法配有特异性引物可进行Uu单项检测，两种方法不一致结果需要使用能够分型检测的方法加以证实。

NG的检出率略高于培养法，7例PCR荧光探针阳性、培养法阴性样本中，2例经调查均确诊为淋病，使用头孢曲松8～13 d后复查为阳性，分析为治疗后死亡的病原体；5例尿急、尿痛，无明显淋病症状，按淋病治疗后症状消失，1个月后检测阴性。

PCR荧光探针法和胶体金法检测CT中， PCR探针法检出率高于胶体金法，差异有统计学意义。细胞培养法是目前检测CT的金标准，但在实际应用中该种方法受采集、储存、污染等原因影响较大[5]。胶体金法用于检测抗原，检测时间短且操作简单，在我国临床上广泛采用，但敏感性较低，且结果受分泌物采集方式、采集量多少及人工判读结果误差等诸多因素影响。Kelly等[6]研究发现，检测抗原CT敏感性及特异性分别为53%、99%，特异性强但敏感性低，而PCR核酸检测特异性及敏感性高，分别为98%、99.4%。本次研究与以上数据基本相近，有2例核酸检测阴性样本继续随访监测中。

PCR荧光探针法和酶联法检测HSV-2中，检出率差异具有统计学意义。PCR探针法检出率低于酶联法，与张立丽等[7]研究数据基本一致。酶联法检测既可证实既往感染，有利于回顾性诊断，同时也可用于恢复期或复发性疱疹的诊断。16例PCR探针法阴性、酶联法阳性，说明在现症感染中PCR探针法更具有优势。

PCR探针法在检测隐匿感染和症状不明显的淋病患者时优于培养法[8]；检测CT可提高亚临床或无症状感染患者的检出率，优于胶体金法；检测Uu虽特异性较高，但无法进行药物敏感性分析，不能指导临床合理用药，无法区分定植或其他分型支原体；HSV检测更适用于现症感染的检测，不适用于既往或复发的诊断。PCR荧光探针法具有敏感性高、操作方便、污染性低等优点[9]，单管取材即可检测多种病原体检测，并且可以尿液作为检测样本，无入侵式采样方式更容易被接受,但仅依据核酸阳性(PCR 探针法检测)进行治疗可能存在过度治疗和抗菌药物滥用的风险，还需结合临床表现、流行病学接触史及多种方法判断。