氟苯尼考胶体金免疫层析定量检测方法的建立

韩姣姣+胡莉明+易扬+刘苗+夏骏+徐国茂+罗凯+王琦+赖卫华

摘 要 建立了定量检测氟苯尼考的胶体金免疫层析方法。对胶体金标记抗体时溶液pH和抗体浓度、金标抗体用量、检测线上抗原浓度以及检测时间进行了优化。采用胶体金试纸条读取仪测定试纸条检测线和质控线的信号强度，以标准品的浓度为横坐标，阳性样本和阴性样本的检测线/质控线的信号比值（Bx/B0）为纵坐标建立标准曲线。结果表明，胶体金免疫层析试纸定量检测氟苯尼考的线性范围为0.1～1.5 ng/mL，检出限为0.08 ng/mL，检测时间为15 min。本方法具有简便、快速和可定量等特点，适于大批量样品的现场筛查。

关键词 胶体金； 氟苯尼考； 免疫层析； 定量检测； 试纸条

1 引 言

氟苯尼考（Florfenicol， FF）又称氟甲砜霉素，是美国先灵-葆雅公司于1988年研制成功的一种新型兽医专用氯霉素类广谱抗菌药[1]，被广泛用于水产和畜禽养殖中[2]。研究表明，氟苯尼考具有血液系统毒性、胚胎毒性[3]和免疫抑制作用[4，5]，动物用药后会出现短暂的厌食、腹泻等不良反应[3]。在养殖过程中，氟苯尼考的过度使用会造成其在动物性食品中产生残留，进而对消费者的身体健康构成潜在威胁[6]，并导致耐药菌的产生[7，8]。因此，各国相继规定了氟苯尼考在动物性食品中最高残留限量标准，我国农业部235号公告规定其在猪肉中的最高残留限量为300 μg/kg[9]。

目前，氟苯尼考的检测方法主要有高效液相色谱法[10]、气相色谱法[11，12]、液相色谱-质谱联用法[13，14]、气相色谱-质谱联用法[15]和酶联免疫吸附法[16，17]。这些方法的灵敏度高，重现性好，其中国家标准方法为液相色谱-质谱联用法[18]，但样品的前处理比较复杂、耗时较长，需要专业人员且需要特定的仪器设备。

胶体金免疫层析法是近年来发展迅速的一项快速检测技术，其特点是简便、高效、成本低、污染小，非常适合于大批量样品的现场筛查[19～21]。Zhu等[22]和Guo等[23]建立了胶体金免疫层析法检测氟苯尼考，检出限分别为1.0 μg/mL和1.0 ng/mL，但只适于定性检测。氟苯尼考的其它快速定量检测方法，如极谱法[24]、旋光分析法[25]和分光光度法[26]等，特异性不强、干扰因素较多，一般用于检测制剂产品中氟苯尼考的含量，较少用于动物源食品中残留检测分析。本研究以胶体金为标记物，采用竞争抑制原理，结合胶体金试纸条读取仪，建立了高灵敏的氟苯尼考胶体金免疫层析定量检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

XYZ-3050型三维喷点平台（美国Bio-Dot公司）； HGS-201可编程切条机（杭州峰航科技有限公司）； TGL-16型高速冷冻离心机（湘仪仪器开发有限公司）； 胶体金试纸条读取仪（上海互帼科学仪器有限公司）。

K2CO3（上海化学试剂公司）； 氟苯尼考全抗原（FF-BSA）、抗氟苯尼考单克隆抗体（北京百奥泰安科技有限公司）； 羊抗鼠多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）； 样本垫、结合垫、硝酸纤维膜（NC膜）、吸水纸和底板（PVC板）购自上海金标生物技术有限公司； 甲砜霉素（Thiamphenicol， TAP）、氟苯尼考胺（Florfenicol Amine， FFA）和氯霉素（Chloramphenicol， CAP）购于美国Earthox公司； 氟苯尼考标准品、牛血清白蛋白（Bovineserum albumin， BSA）、氯金酸和柠檬酸三钠（美国Sigma公司）； 猪肉购自本地超市； 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）； 其余试剂均为分析纯。

2.2 实验方法

2.2.1 膠体金的制备[27] 取0.01%（w/V）氯金酸溶液100 mL，加热至沸腾后，快速加入1.45 mL 1%（w/V） 柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色变至紫红色后停止加热，持续搅拌直至冷却至室温。

2.2.2 胶体金标记抗体的制备 取胶体金溶液1 mL，用0.2 mol/L K2CO3调节溶液至pH 6.5。边搅拌边缓慢滴加100 μL用超纯水溶解和稀释的抗氟苯尼考单克隆抗体溶液，常温下搅拌30 min后， 加入10%（w/V）BSA溶液100 μL，继续搅拌30 min； 4℃，8500 r/min离心30 min，弃上清液，以100 μL重悬液（0.01 mol/L PBS，5% 蔗糖； 2% 海藻糖，1% PEG-20000，1% BSA （w/V），0.25% Tween-20 （V/V））重悬沉淀。

2.2.3 样品的预处理 取猪肉样本3 g，匀浆后，加乙酸乙酯6 mL， 振荡10 min后，室温下4000 r/min离心10 min。取4 mL上层有机相，50 ℃下用氮吹仪吹干，加入正已烷1 mL，涡旋混匀30 s，再加入0.01 mol/L PBS缓冲液（pH 7.4） 1 mL，涡旋混匀1 min后，室温下4000 r/min 离心17 min。弃上层有机相，取下层溶液用于后续分析。

2.2.4 胶体金免疫层析法的建立 取0.2 mg/mL 氟苯尼考全抗原和0.6 mg/mL羊抗鼠多克隆抗体，采用XYZ-3050型三维喷点平台以0.76 μL/cm的喷量喷于NC膜上，分别作为检测线（T线）和质控线（C线）。将喷好的NC膜置于37 ℃真空干燥箱中干燥2 h。在底板（PVC板）上依次粘贴样本垫、结合垫、NC膜、吸收垫，并切成4 mm宽的试纸条，如图1所示。取2 μL 金标抗体溶液和100 μL 样品溶液加入到酶标孔中，孵育3 min后滴加到试纸条的样本垫上[21]，15 min后用胶体金试纸条读取仪测定结果。

2.2.5 实验条件的优化 将0.2 mol/L K2CO3溶液加入到1 mL 胶体金溶液中，调节胶体金溶液的pH值至5.5、 6.0、 6.5、 7.0和7.5后进行抗体标记，分别对阴性样本进行检测，确定最佳pH值。

将0.05、 0.1、 0.2、 0.4和0.8 mg/mL的氟苯尼考全抗原分别喷在NC膜的T线上，分别对阴性样本和阳性样本（0.5 ng/mL）进行检测，确定最佳T线抗原浓度。

将2、 4、 6、 8和10 μg的抗氟苯尼考单克隆抗体分别与1 mL 胶体金进行标记，分别对阴性样本和阳性样本（0.5 ng/mL）进行检测，确定最佳胶体金标记抗体浓度。

取1.3、2.0、2.7、3.3和4.0 μL的金标抗体分别用于阴性样本和阳性样本（0.5 ng/mL）的检测，确定最佳金标抗体用量。

2.2.6 检测时间的确定 将阴性样本和阳性样本（0.5 ng/mL）分别与金标抗体均相反应3 min后，加入到试纸条的样本垫上。2 min后，用胶体金试纸条读取仪每30 s测定一次T、C线信号强度，共持续39 min。以时间为横坐标，T、C线信号强度和T/C值（T线与C线信号强度比值，AT/AC）为纵坐标，绘制免疫反应动力学曲线，选取最佳检测时间。

2.2.7 胶体金免疫层析试纸条的性能评价

取FF标准品分别用液相色谱-质谱法确证的阴性猪肉样本提取液配置成一系列（0、0.02、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8和2.0 ng/mL）的标准溶液，用试纸条进行检测后，以氟苯尼考标准溶液的浓度为横坐标，阳性样本比阴性样本的T/C值（Bx/B0）为纵坐标绘制标准曲线，其中Bx为阳性样本T线和C线的信号强度比值，B0为阴性样本T线和C线的信号强度比值。参考Anfossi等[28]的方法定义本方法的检出限，以20个阴性猪肉样本检测平均值减去3倍标准差得出本方法的检出限。抑制率计算公式为1-Bx/B0。

取FFA和CAP标准品分别用0.01 mol/L的PBS溶液（pH 7.4）配制成100 ng/mL的标准溶液，TAP和FF则配制成1.5 ng/mL的标准溶液。用本实验建立的免疫层析法进行检测，每个条件重复3次。

将猪肉样本提取液分别添加3个浓度的FF （0.2、0.5和1.0 ng/mL），选用同一批次和不同批次的试纸条对其进行检测，重复3次，计算不同浓度下的批内与批间精密度（相对标准偏差）。

3 结果与讨论

3.1 检测原理

本研究采用竞争免疫层析原理。当样品中不含有氟苯尼考时（阴性样本），金标抗体在毛细管作用下沿着NC膜移动并被固定在T线上的FF-BSA捕获。当样品中含有FF时（阳性样本），金标抗体与样本溶液中的FF结合而不能被固定在T线上的FF-BSA捕获，T线信号强度随着样本中FF浓度的增加而降低。剩余的金标抗体会与固定在C线上的羊抗鼠二抗结合。通过胶体金试纸条读取仪记录试纸条上T线和C线信号强度，以FF标品浓度为横坐标，阳性样本和阴性样本的检测线/质控线的信号比值（Bx/B0）为纵坐标建立标准曲线，实现氟苯尼考的快速定量检测。

3.2 优化实验条件

标记时胶体金溶液的pH值会影响抗体的活性与结合效率[29]，由图2A可知，当胶体金溶液pH=6.5，T线信号值最大（T线信号值为2138）。

由图2B可知，T线信号强度随着氟苯尼考全抗原（FF-BSA）浓度的增加而逐渐增强。

0.2 mg/mL时，T线信号值相对较强，抑制率最高（T线信号值为1450.5，抑制率为61.2%），抗原的用量也较少。

由图2C可知，标记胶体金时，当所用的抗氟苯尼考单克隆抗体的浓度为6 μg/mL时，T线信号强度和抑制率都相对较高（T线信号强度为1646，抑制率为62.2%），SD也相对较小，抗体较少，成本也相應降低。

由图2D可知，T线和C线信号强度随着金标抗体用量的增加而逐渐增强，但抑制率却逐渐降低。这是由于待检物的量一定时，金标抗体的用量越多，则与T线上氟苯尼考全抗原和C线上羊抗鼠多克隆抗体结合的越多。当金标抗体的用量为2.0 μL时，抑制率最高且阴性样本T线与C线信号值较强（T线信号强度为1536，C线信号强度为722，抑制率为56.1%）。

图3中A和B分别为阴性样本和阳性样本免疫反应动力学曲线，随着时间延长，T、C线的信号强度均增加，而T/C线的强度比值（T/C值）逐渐趋于稳定。当加样15 min后，T/C值基本保持不变，故检测时间确定为15 min。

3.3 胶体金免疫层析试纸条的分析性能

采用胶体金免疫层析试纸条检测FF的标准曲线如图4A所示，线性范围为 0.1～1.5 ng/mL，线性方程为y=0.5735x + 0.9001。其中，x表示氟苯尼考浓度（ng/mL），y表示Bx/B0（Bx为阳性样本T线和C线的信号强度比值，B0为阴性样本T线和C线的信号强度比值），R2=0.9848，检出限为0.08 ng/mL。

3.4 特异性

用所制备的免疫层析试纸条分别检测FFA、CAP、TAP和FF。当待检物为FFA和CAP时，抑制率分别为4.8%和3.4%。当待检物为TAP和FF时，抑制率分别为75.7%和89.8%。这是由于FF是TAP的氟化物，两者在化学结构上较为相似，因此TAP能与抗氟苯尼考单克隆抗体结合而发生交叉反应。

3.5 重复性评价

选用不同批次的试纸条，对加标水平为0.2、0.5和1.0 ng/mL的阴性猪肉样本提取液进行检测，结果如表1所示，试纸条的批内回收率为90.5%～103.5%，批间回收率为90.8%～101.2%。

3.6 与LC-MS/MS方法的比较

用氟苯尼考胶体金免疫层析试纸条与国标法（LC-MS/MS）[18]同时检测18份不同的猪肉样品，根据实验结果绘制线性相关曲线（图5）。两种方法的线性相关系数（R2）为0.9886，11个阴性样本和7个阳性样本的检测结果一致（阈值为300 μg/kg）。本研究建立的氟苯尼考免疫层析法定量检测结果准确可靠。

4 結 论

建立了氟苯尼考胶体金免疫层析定量检测方法，对影响胶体金免疫层析试纸条的主要因素进行了优化。试纸条的检出限为0.08 ng/mL，线性范围为0.1～1.5 ng/mL，检测时间为15 min。本方法具有操作简单、稳定性好和灵敏度高等特点，可以满足猪肉中氟苯尼考的限量检测，适合于大批量样品的快速筛查，有较好的应用前景。

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