某院耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药性分析*

陈寅，栾和伟(江苏省人民医院句容分院检验科，江苏句容 212400)

鲍曼不动杆菌是引起医院内感染的重要条件致病菌之一，容易引起医院内和医院间的感染暴发流行和跨地区的水平传播。鲍曼不动杆菌感染通常发生于身患严重疾病、正在接受侵袭性操作和免疫抑制剂治疗以及抵抗力低下的患者，可引起呼吸道感染、伤口及术后感染、继发性脑膜炎、败血症和尿路感染等。β-内酰胺类抗菌药物特别是碳青霉烯类抗菌药物，曾被认为是有效的治疗药物，广泛用于控制鲍曼不动杆菌感染[1]。然而，近年来鲍曼不动杆菌对其耐药率不断上升，耐药菌株在院内甚至地区间存在播散，为医院感染防控带来挑战。本研究通过对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药基因和耐药性进行分析，以期为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的有效治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1菌株来源 收集江苏省人民医院句容分院2019年1月—2020年12月临床分离的对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌47例，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌ATCC19606，均来源于卫生部临床检验中心。患者年龄为26～96岁；其中，男性35例(74.5%)，女性12例(25.5%)；大于60岁患者33例(70%)。47株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌来源于痰标本43株(91%)，来源于胸水、血液、尿液以及伤口分泌物各1株；来源于重症监护病房(ICU)23例(48.94%)，呼吸内科10例(21.28%)，神经外科6例(12.77%)，神经内科5例(10.64%)，骨科2例(4.26%)，肿瘤科1例(2.13%)。

1.2主要仪器与试剂 Vitek 2 Compact 全自动微生物分析系统及配套革兰阴性菌鉴定GN卡和药敏GN335卡(法国生物梅里埃公司)，血平板、麦康凯平板及巧克力平板(郑州安图生物公司)，PCR扩增仪(美国ABI公司)，电泳分析成像系统(上海复日科技公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技公司)，PCR试剂、引物合成(上海迈浦生物科技有限公司)。

1.3细菌培养和药敏试验 菌株的分离、培养参照《全国临床检验操作规程》(第4版)[2]进行。微生物的鉴定和药敏分析用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统及配套革兰阴性菌鉴定GN卡和药敏GN335卡。结果判定参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100 2020年标准。

1.4耐药基因检测 引物设计参考文献[3]，合成鲍曼不动杆菌耐药基因blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51和blaOXA-58引物，引物信息见表1。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。采用多重PCR法检测菌株携带耐药基因。PCR反应体系为20 μL，包括2×Taq Master Mix (Dye Plus)预混液10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，细菌模板2 μL，加双蒸水补足体系至20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统分析。

表1 碳青霉烯酶基因的引物序列及扩增产物大小

1.5统计学分析 采用WHONET5.6软件进行数据统计分析，用Excel表进行最终敏感、中介和耐药的计算。

2 结果

2.1药敏试验结果 47株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对亚胺培南等16这种临床常用抗菌药物的药敏试验结果见表2。所有菌株对碳青霉烯类抗菌药物(亚胺培南和美罗培南)、β-内酰胺酶抑制剂类抗菌药物(替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦)、单环β-内酰胺类抗菌药物(氨曲南)以及三代头孢菌素类(头孢他啶)具有耐药性。所有菌株对多肽类抗菌药物黏菌素敏感；只有2株对四环素类替加环素有抗性(耐药性4.2%)；磺胺类复方磺胺甲噁唑对近一半的菌有抑制效果(敏感性46.8%)。

2.2基因检测结果 47株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌中，blaKPC-2、blaIMP、blaVIM以及blaGES基因检测结果为阴性，2株检出blaOXA-24(4.3%)，32株检出blaOXA-58基因(68.1%)，38株检出blaNDM-1基因(80.9%)，42株检出blaOXA-23(89.4%)，47株检出blaOXA-51基因(100%)。部分电泳结果见图1、图2。

表2 碳青酶烯类耐药鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的耐药性(%)

注：M，DL 2 000 DNA marker;1～2,空白对照;2～6，blaNDM-1基因阳性扩增产物，大小为982 bp。

注：M，DL 2 000 DNA marker;1，空白对照;2～5，blaOXA-51基因阳性扩增产物，大小为353 bp；6，ATCC 19606标准菌株。

3 讨论

对碳青霉烯类药物耐药的鲍曼不动杆菌在世界范围内的广泛流行，被世界卫生组织列为对现代医学构成最大威胁的耐药菌之一[4]。根据2018年CHINET数据显示，鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为77.1%和78.1%，是2006年耐药率的近2倍[5]。本研究中耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌除黏菌素(耐药率0)、替加环素(耐药率4.2%)和米诺环素(耐药率48.9%)外，对其他抗菌药物的耐药率>50%，建议使用联合用药，亚胺培南+多黏菌素E和米诺环素+多黏菌素E两种组合对CRAB具有更好的抑菌效果[6]。本研究中的菌株70%为60岁以上患者，91%来源于痰标本，这可能与其传播途径和鲍曼不动杆菌的致病机制有关，因为鲍曼不动杆菌自身黏附能力极强，可以黏附在人体的不同组织和器官中引起感染，尤其是对人体的肺支气管上皮细胞的亲和力最高，因此极易通过外界气体传播或在支气管插管、气管切开等操作过程中进入呼吸道[7]，引起上呼吸道的感染[8]。文献报道，老年多重耐药鲍曼不动杆菌肺炎患者采用替加环素辅助治疗，可有效改善患者的临床症状，降低患者的炎症因子水平，同时具有较高的药物安全性[9]。

临床分离耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制复杂，与产生碳青霉烯酶、外排泵基因、整合子基因的大量表达均有关[3]。鲍曼不动杆菌耐药机制中以产碳青霉烯酶为主。在耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分离菌株中，与碳青霉烯水解酶相关的有A、B和D类碳青霉烯酶，A类中blaGES型分布中东地区，而blaKPC型罕见；B类为金属β-内酰胺酶，具有更强的水解活性[10]，其中blaIMP、blaVIM、blaNDM型在鲍曼不动杆菌中均有检出；D类blaOXA型酶在对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性中具有更重要的作用[11]。本研究中38株检出blaNDM-1基因(80.9%)，42株检出blaOXA-23基因(89.4%)，碳青霉烯酶流行情况同上述研究结果相同。blaOXA-51基因是鲍曼不动杆菌染色体携带的天然耐药基因，多数学者认为blaOXA-51基因可以作为快速确定鲍曼不动杆菌的一个分子标记[12]，本研究结果也支持上述观点，所有菌株均检出blaOXA-51基因。此次分析的47株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌blaOXA-23检出率为89.4%，高于四川地区某院48 株碳青霉烯类鲍曼不动杆菌blaOXA-23检出率70.8%[13]，说明不同区域、不同等级医院耐药基因的检出率存在一定的差异，这可能于各个医院的用药习惯、抗菌药物的限制和菌株流行情况有关。另外，本研究中38株检出blaNDM-1基因，而携带blaNDM-1的细菌具有强大的致病力和耐药性，对碳青霉烯类、β-内酰胺类、氨基糖苷类等抗菌药物耐药，需合理选择抗菌药物治疗。在鲍曼不动杆菌中，blaNDM-1基因位于可移动元件质粒上，携带blaNDM-1的鲍曼不动杆菌可通过质粒接合，使其获得部分耐药性，该基因具有跨种属转移的能力，需加强对产blaNDM-1细菌的检测，预防其暴发流行[14]。