荧光探针在游离肼检测中的研究进展

李怿

摘      要：肼是20世纪40年代火箭的经典推进剂，同时被广泛用作塑料发泡剂。此外，肼由于其还原性和碱性，还经常用于合成油漆、药物和杀虫剂。然而，肼对人体具有相当大的毒性作用，包括对眼睛和皮肤的刺激、对肝脏、肾脏和中枢神经系统的损害。因此对肼进行准确测定意义重大。荧光测定法由于其无创性和良好的灵敏度，更适合生物应用。介绍了肼探针的最新研究进展。

关  键  词：肼;荧光探针;细胞成像

中图分类号：TQ 422       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）02-0422-06

Abstract：  As a classic propellant for rockets since 1940s，hydrazine is wildly used as blowing agent for plastics. In addition，hydrazine is often used in the synthesis of paints，pharmaceuticals and pesticides，due to its reducibility and alkalinity.However，hydrazine exhibits considerable toxic effect upon human，which includes irritation to the eyes and skin，damage to the liver，kidneys，and the central nervous system.Therefore，it is necessary to carry out accurate detection of hydrazine. The fluorometric method is expected to be more desirable for biological application because of its noninvasiveness and good sensitivity. In this paper， recent research progress of hydrazine probes was reviewed.

Key words：  hydrazine; fluorescent probes; cellular imaging

肼作为一种重要的工业原料，广泛应用于许多领域，包括防腐、感光化学品、纺织染料、制药和乳化剂。肼作为一种具有相当高燃烧焓的试剂，被用作火箭和导弹的推进剂 [1]。然而，肼也是一类高毒性的化学物质，很容易通过皮肤或呼吸直接吸收，因此在使用时应格外小心。过度吸收会导致呕吐，刺激呼吸系统，甚至对肝脏、肺、肾脏和人类中枢神经系统造成严重损害。根据美国环境保护署的鉴定，肼是一种可能致癌的物质，其新限值为10 ppb。因此，开发高灵敏度和选择性肼探针非常重要 [2，3]。传统的检测生物肼方法包括高效液相色谱、毛细管电泳分离、电化学以及质谱法等，然而，这些常规方法存在耗时、灵敏度低、过程复杂等缺点，限制了肼检测的实际应用 [4]。而利用荧光探针检测游离肼具有操作简便、分辨率高、具有可选择性、与底物识別灵敏度高、检测限低以及可细胞内成像等优点，近年来得到了广泛的研究 [5，6]。然而，它们中的大多数是荧光“开启”或“关闭”探针，仅使用一个荧光信号，由于不可避免的干扰，如检测环境、仪器调节探针的浓度，其灵敏度明显不足。相比之下，使用多个互连荧光信号的比率荧光探针在很大程度上克服了这些问题。因此，一种响应速度快、灵敏度高、具有体内成像能力的稳健比率荧光探针具有广阔的应用前景和较高的实用价值。

肼被广泛应用于各领域中的合成与应用，同时也带来了巨大的环境污染风险。目前已开发的探针主要应用与水体环境游离肼，生物细胞内成像等领域。目前的设计思路主要是通过分子内电荷转移机理来设计比色型荧光探针。检测游离肼是一个目前在荧光探针研究领域的前沿方向，具有广阔的研究前景和研究价值。以与肼发生反应的基团来分类，主要可以分为乙酰基结构探针，乙烯丙二腈及烯烃结构探针，四溴丁酰基结构探针，邻苯二甲酰亚胺结构探针四类。

1  常见的检测游离肼的荧光探针反应原理

检测游离肼的分子探针通常为（on-off）荧光探针，一般的（on-off）型荧光分子探针的反应机理包括光诱导电子转移（Photoinduced Electron Transfer， PET）和分子内电荷转移（Intermolecular Charge Transfer， ICT）以及聚集诱导发射增强（Aggregation- Induced Emission Enhancement，AIEE）等。其中，光诱导电子转移型荧光探针一般结构如图1a所示，被用于设计“ON-OFF”型荧光探针。在激发光发射的条件下，荧光团会产生相应的激发电子，此时受体与连接的荧光之前会发生电子转移，激发态电子会位于荧光团的最低空轨道与最高空轨道之间，导致荧光团的激发态电子无法回到基态，发生荧光淬灭，表现为“OFF”状态。而探针受体部分与靶分子结合时会阻断荧光团与受体的内部电子流动，而导致发射出荧光[7]。

基于ICT机理构建的探针在与被测物反应前后，探针的电子供体或电子受体的供/吸电子能力发生改变，从而产生了新的电子分布，新的不均匀的电子分布会使得荧光吸收光谱发生新的红移或蓝移，相应的荧光强度也会发生一定变化。[8]一般的，ICT探针由两个部分组成：由电子供体（D： donor）和电子受体（A： acceptor），组成了电子推拉系统。当受到激发光照射，产生电子激发时会导致整个荧光探针中电子不均匀分布，从而使得分子偶极距改变，产生新的偶极子。当目标分子与探针相应位点成键后，会导致整个体系的偶极距再次发生变化，由新的电子分布诱导分子内的电荷转移。这种机理常用于比色型荧光探针的设计[9]。

此综述中，所涉及的荧光探针主要为分子内的电荷转移机理主导的比色型荧光探针。

2  目前应用于检测游离肼的荧光探针

2.1  具有乙酰基结构的肼探针

2011年，Chang[10]等首次报道和提出了可以利用荧光探针检测游离肼的概念。该探针由于具有乙酰丙酸酯结构（如图2所示），可以与游离的肼发生肼解，改变了原有荧光团的电子分布，导致探针的荧光性质发生了改变。该探针易于合成与纯化，结构稳定，在中性pH值下具有一定的反应性。在探针与荧光分子结合发生肼解反应后，产生了黄绿色荧光，在440 nm处有显著的紫外特征峰。荧光最大吸收波长为440 nm，最大发射波长为475 nm，与游离肼反应后具有显著的荧光增强现象。然而该探针在检测的过程中存在背景荧光干扰大，溶解性一般，无法透过细胞膜，仅能应用于水体中的游离肼检测。

2013年，Chang[11]等开发了两种基于苯乙酸盐的荧光探针，分别通过在二氯荧光素和间苯二酚荧光团支架上掺入乙酸基团来检测肼。在二甲基亚砜（DMSO）和Tris缓冲溶液（pH=8.0，10 mM，1∶1，v/v）的混合物中，探针1是无色和非荧光的。用探针检测溶液中游离肼时，可以观测到待测溶液的荧光吸收光谱发生了显著变化，512 nm处产生新的强吸收峰，肉眼可观察到相应的颜色变化，待测液由从无色变为黄绿色，并且可以在534 nm处产生显著绿色荧光，这是游离二氯荧光素的特征光谱特征。探针2与游离肼也可以发生类似的肼解反应，同样有明显的显色和荧光增强信号。1和2对肼均表现出优异的选择性，对工业化学检测要求来说足够灵敏。其缺点是很难应用于细胞检测，具有一定的细胞毒性（如图3所示）。

2013年，Peng[12]及其同事报道了基于CyrA衍生物荧光探针。在肼存在于乙酸缓冲液（pH=4.5，10毫摩尔）和二甲基亚砜（1∶9，v/v）的混合物中的情况下，该探针经历肼解过程释放烯醇，烯醇进一步转化为其相应的酮形式，导致吸收和发射最大值的高移。在荧光探针的肼解过程中，溶液的颜色发生显著变化，荧光发射波长由784 nm转变为520 nm，荧光发射光谱主要发射峰由810 nm变为582 nm。在582和810 nm处的荧光强度比随着肼的浓度线性增加。该探针被成功地用于活的MCF-7细胞系中肼的成像和小鼠中（如图4所示）。

2015年，Sun[13]等通过在萘酰亚胺（一种广泛用于构建荧光探针的结构）上加入乙酸酯基团，开发了新型荧光肼探针，该探针在432 nm处显示出最大荧光。

加入肼后，432 nm处的发射强度逐渐降低，同时在荧光发射光谱中可以发现新的发射峰，其主要发射带为543 nm，从而提供比率检测和细胞成像。但是此荧光探针的响应时间较慢，灵敏度一般。这也是乙酰丙酸脂类探针共有的缺点。大部分此类探针的响应时间大于15 min（如图5所示）。

乙酰丙酸酯结构类探针往往具有相应时间较长，灵敏度一般的特点，未来在设计乙酰丙酸结构探针时需要可以考虑到这一点，同时选用适宜的荧光团来提高生物相容性，使探针的应用范围更广。

2.2  具有乙烯丙二腈以及烯烃缺电子结构肼探针

2012年，Fan[14]等首次报道了以7-二乙基氨基-1，4-苯并噁嗪-2-酮（DEAB）为母核的检测游离肼的荧光探针。由于DEAB分子是非对称的，其激发态偶极矩远大于基态偶极矩。而发射波长可以通过改性进一步发展到近红外区域。电子供体和受体应该分别位于DEAB的3-和7-位。因此，在DEAB中引入了3-甲基丙二腈基团（电子受体）以探针，亚芳基甲基丙烯腈和肼之间的特定反应产生腙的产物，该产物影响分子内电子密度分布，因此导致对水溶液中肼的吸收荧光比率反应。此外，此探针可以穿透活细胞并定位在溶酶体中以显现。这也是肼探针首次在细胞内成功应用。但是此方法存在背景噪音大，抗离子干扰弱的缺点，限制了其进一步的应用（如图6所示）。

2014年Yang[15]等将丙二腈触基团加入吩噻嗪中，形成肼探针。在DMF-Tris缓冲液（10 mM，pH=7.4，7∶3，v/v）中与肼反应后，由于探针与肼发生分子内反应，形成了腙，探针电子分布发生变化，新的混合物在荧光发射光譜于490 nm的处荧光发射增强现象。该探针显示肼的动态范围为5.0～20.0微米，检出限为1.2×10-8 m。此外，该探针具有稳定的生物相容性，已成功应用于活细胞成像以及活体斑马鱼肼的可视成像化（如图7所示）。

2019年，Qiu[16]等优化了该探针，通过用丙二腈基团修饰10-丁基-2-甲氧基-10H-吩噻嗪-3-甲醛，研制了一种比率式选择性检测肼的新型荧光传感器PBM。探针PBM与之前的探针相比具有响应速度快（10 min）、斯托克斯位移显著选择性好、灵敏度高（63.2 nM检测限由体外实验获得）、比率变化大（82倍）和对肼的细胞毒性低的优点。此外，它还可以通过颜色变化监测各种浓度的气态肼，并以优异的性能对生活在MCF-7 cells的肼进行成像。是目前较为理想的肼荧光探针（如图8所示）。

2016年Liu[17]等将二氰基乙烯基引入衍生的四苯乙烯（TPE）部分，设计了一系列聚集诱导发射（AIE）探针，用于溶液和固态肼的荧光和比色检测，基于探针染色的试纸条。其设计思路是通过引入不同的给电子基团，使整个体系的电子分布发生改变。比如将给电子基团与四苯乙烯结合，产生的探针在可见光区具有更红移的吸收和发射。这种方法中具有甲氧基的四苯乙烯对肼的响应最好，可以作为检测试纸检测低浓度的肼蒸汽。乙烯基丙二腈作为识别部分，通过使用各种荧光团支架或它们的衍生物，包括苯并噻唑[18]、咔唑[19]、苊醌[20]、蒽醛[21]、萘并噁唑[22]、甲酰化苯并噻唑[23]和二氰甲基‐4H‐色烯[24]等，都可以用于开发荧光肼探针（如图9所示）。

除了乙烯基丙二腈，其他一些缺电子的烯烃结构也可以通过类似的机制与肼反应生成腙。基于这种类型的反应，2013年Lin，[25]2017年Wang[26]等报道了新的荧光肼探针。基于2-氰基丙烯酸酯作为识别单元的两个探针，已经通过使用两个不同的荧光团—吡啶并甲基和菲并咪唑来设计。基于肼引发探针π-共轭体系的降解，合成了肼检测的比色型荧光探针（如图10所示）。

2.3  具有四溴丁酰基结构的肼探针

肼的分子构成可以视为两个氨基共轭连接，这表明它具有两个可以用于反应的氨基位点，在特定条件下可以进行两次亲核反应。因此，利用这种特殊的反应性，一些课题组设计对肼具有优异选择性的荧光探针。大部分此类探针的设计原理是利用肼的双重亲核能力，4-溴丁酸酯基团被用作肼探针设计的反应部分。这种类型的荧光探针通常通过将4-溴丁酸盐掺入含酚荧光团来制备。反应机理主要为肼首先亲核取代溴原子，然后对酯羰基进行亲核攻击，经历分子内环化过程释放出相应的酚荧光团（如试卤灵，荧光素，香豆素等）。

2013年Goswami[27]等首先开报道了一种荧光肼探针，采用4-溴丁酸酯作为反应部分。肼的存在可导致HBT部分的释放，用以追踪游离肼。此方法可以应用于细胞成像。该探针的主要确定在于HBT的响应释放时间较长，无法做到迅速检测（如图11所示）。

Qian[28]等在2014年报道了具有试卤灵结构的探针。试卤灵是一种非常灵敏的荧光基团，在水溶液中具有显著的粉红色，常被用于当作显色剂使用，当具有试卤灵结构的探针被肼解以后，会直接释放出试卤灵基团，溶液由无色变为粉红色，是一种良好的肼的肉眼探针。相应的，其缺点也在于试卤灵分子很难作为活细胞肼检测探针使用，往往只能应用于体外实验（如图12所示）。

目前很多课题利用不同的荧光团上加入4-溴丁酰基开发了一系列不同颜色的荧光肼探针。基于荧光素，Goswami[29]等报告了一种“开启”荧光探针。通过利用二氰甲基二氢呋喃支架，Li[30]等制备了一种远红外荧光肼探针。Zhu[31]等开发了两种基于类黄酮的荧光肼传感器，它們都已应用于活细胞中肼的检测。Chen[32]等报道了一种基于香豆素荧光团的高灵敏度肼荧光开启探针。

2.4  具有邻苯二甲酰亚胺结构的肼探针

这种荧光探针的机理是邻苯二甲酰亚胺被目标伯烷基卤进行氮烷基化，然后肼解邻苯二甲酰基团，此过程中会释放出伯胺。一般的设计思路是将邻苯二甲酰亚胺与含胺的荧光团共轭连接，然后肼解释放荧光团来达到检测的目的（如图13所示）。

2014年Zhao[33]等报道了以丹磺酰氯为母核的具有邻苯二甲酰亚胺结构的肼探针，在HEPES缓冲液（pH=7.0，20 mM）和DMSO（1/9，v/v）的溶液中合成了一个开启荧光肼探针（如图14所示）。探针仅在475 nm（?=0.093）显示极弱的荧光，肼的加入导致“开启”发射（?=0.498 3），红移至512 nm。但是这种探针最大的问题在于选择性较差，邻苯二甲基亚胺结构有可能会被环境中的其他物质解离。

值得注意的是，2014年，Cui[34]等报道了一种用于肼特异性检测的探针。探针的肼解可以产生游离的7-氨基-4-甲基香豆素用作检测信号。

该探针相比于其他邻苯二甲酰亚胺探针来说，具有良好的抗金属离子干扰的能力，荧光背景噪音少，可以用于气态肼与hela细胞中肼的检测。这也是目前较为理想的非生物体内肼检测探针。主要缺点在于暂时无法应用于生物体内成像，生物相容性较差（如图15所示）。

2016年Das[35]等报告了一种基于菲咯咪唑荧光团的荧光肼探针。该探针在其他几种竞争性胺衍生物存在的情况下对肼表现出高选择性，并已用于实时检测异烟肼在活细胞中代谢过程中原位生成的肼。这也是目前具有邻苯二甲酰亚胺结构的探针在活细胞检测中的首次报道（如图16所示）。

通过使用几个其他荧光团基团一些课题组设计了几个其他荧光肼探针，包括吡唑啉[36]、苯并噻二唑[37]、BODIPY[38]、肼-萘酰亚胺[39]、和荧光素[40]。但是这些结构的荧光探针通常都有生物相容性差和抗干扰能力差的缺点。

3  结论

由于肼的广泛工业应用，目前已经开发出来许多在不同介质中（包括在水溶液和有机溶剂、气态和生物系统中）检测肼的有效光学探针。在这篇综述中，系统地总结了已报道的荧光肼探针。这些探针根据与肼发生的反应基团进行分类。这些探针中的一些显示出良好特性，例如高选择性和灵敏度、比率响应高、具有实时检测能力等，但大部分仍然需要进一步细化识别部分和提高探针的生物相容性，以实现高特异性和体内感测。

肼由两个氨基组成，是一种强亲核试剂，可以参与多种亲核反应。目前报道的肼探针大多数具有单一亲电子位点，用于肼的亲核攻击。但是这种类型的探针可能具有较差的选择性、较慢的反应速率或较差的稳定性。然而，一些探针具有两个亲核反应位点，利用肼的能力进行两个连续的亲核反应，从而获得高选择性。

未来肼探针的发展方向可以继续利用肼独特的双亲核特性来设计新的高特异性识别部分，从而设计更有效的探针，这些探针有望通过结合肼的各种亲核特性来提供多种可能性。 AIE探针在生物系统中也是可行的，但是通过利用发光聚集实现开启荧光响应这种肼探针报道很少。这也是未来探针发展的一个重大方向。

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