MicroRNA-520b靶向白介素-2调节肝癌细胞生长、转移和药物敏感性研究*

肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤， HCC的发生与肝炎病毒感染、酗酒、化学致癌物等多种因素相关。HCC的治疗包括手术、靶向治疗药物如索拉菲尼、肝移植等多种方法，但复发比例较高。白介素-2(IL-2)是一种淋巴因子，对于癌细胞有杀伤作用。microRNA是一种非编码单链小RNA分子，参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等众多生物学进程。microRNA与靶向调节基因结合，实现调控靶基因蛋白的表达，microRNA的调控作用在肝癌、胰腺癌等多种肿瘤中均有体现

。microRNA-520b(miR-520b)被发现在肺癌、乳腺癌等肿瘤中表达降低，其可能对肝癌细胞也具有调控作用

，但关于miR-520b与肝癌之前的关系尚无研究报道。miR-520b可调节多种基因，包括一些炎症因子。我们推测miR-520b可能对IL-2具有靶向调节作用。本研究拟探究miR-520b靶向IL-2调节肝细胞的生长、转移的特点。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞 收集2019年3月至2020年3月在我院手术切除并经病理确诊的42例原发性肝细胞癌患者术后肝癌及其癌旁组织。患者平均年龄(54.3±4.56)岁；肿瘤直径3.2～10.6 cm；Child肝功能分级A级20例，B级22例。标本取材2 cm组织。患者纳入标准：经病理诊断确诊为原发肝细胞癌，癌旁组织无癌残留。排除标准：化疗、放疗患者；合并其他肿瘤者；严重感染者。研究获得患者同意并通过医院伦理委员会批准。选择肝癌细胞系HepG2开展细胞实验。

麋鹿小姐紧了紧怀中的酒，仿佛这是她唯一的依靠。红色的围巾让这个圣诞节的夜晚显得更有气氛。出租车里的温度很暖，她陷入了回忆中。记得酒刀先生曾对她讲：“温度过高会使葡萄酒成熟速度太快，变得没那么细腻，还缩短了葡萄酒寿命。温度太低又会让葡萄酒成熟非常缓慢，需要等待更长时间。”她总觉得，酒刀先生说的不止是葡萄酒，还有感情。

1.2 主要试剂 Lipofectamine

2000脂质体购自美国Invitrogen公司，MTT试剂盒购自英国Abcam公司， Annexin V-FITC/PI试剂盒试剂盒购自英国Abcam公司，Trizol总RNA抽提试剂购自美国Invitrogen公司，qRT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司，DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购自上海碧云天公司。miR-520b mimiCS和miR-NC购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.3 方法

2.4 3组细胞中miR-520b的表达 见图4。过表达组细胞中miR-520b的mRNA表达水平显著高于对照组和空白对照组(

<0.05)，提示miR-520bmimic转染成功。

1.3.2 RT-PCR检测miR-520b在肝癌组织和癌旁组织中的表达 转染48 h后收集细胞提取并测定总RNA，逆转象合成cDNA，进行PCR检测。反应引物： miR-520b上游：5′-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3′， miR-520b下游：5′-CUCUAAAAGGAAGCACUUUUU-3′， GAPDH上游：5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′， GAPDH下游：5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。反应条件95℃ 3 min,40循环：95℃ 12 s，62℃ 50 s。采用ARI7500软件进行结果分析。

2.5 3组细胞IL-2的表达 见图5。Western blot的结果表明，过表达组细胞的IL-2表达显著高于对照组和空白对照组(

<0.05)。

1.3.3 免疫组织化学观察组织标本 常规方法操作。

2.3 miR-520b对IL-2靶向作用验证 见图3。过表达组细胞中野生型IL-2的3′UTR端荧光素酶报告基因的表达较空白对照组低(

<0.05)。实验验证IL-2是miR-520b的靶基因。

1.3.5 检测细胞迁移和侵袭情况 ①迁移实验：收集生长对数期细胞，制成5×10

个/ml单细胞悬液。在Transwell上室加入200 μl单细胞悬液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养液 500 μl。各组设5个复孔，继续培养24 h，取出Transwell小室用PBS清洗2遍。甲醇固定30 min，0.1%结晶紫室温下染色20 min，PBS 清洗3遍，显微镜观察拍照，计算穿膜细胞数量。②侵袭实验：参照说明书制备有基质胶Transwell小室，其他步骤同迁移实验。

为了这件事，我发挥自身特长草书唐诗一幅，到装裱店加急仿古精裱后如期带去，意外的贺礼，使教师职业的妹妹格外喜爱，她表示，这是锦上添花。

另外，根据式(7)得到的速度估计值vr对目标回波进行粗补偿，即构造式(8)并进行IDFT操作即可得到目标距离的粗估计值R0r：

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-520b对IL-2的靶向调控作用 利用TargetScan软件预测miR-520b与IL-2的结合位点，构建野生型(WT)及突变型(MUT)IL-2的3′UTR双荧光素酶报告基因质粒，并将质粒转染进HepG2细胞，转染48 h后，各组细胞转染miR-520b mimics和miR-NC，后用双荧光素酶分析系统检测各组细胞荧光素酶活性。

2 结果

2.1 肝癌组织和癌旁组织中miR-520b和IL-2的表达 见图1。肝癌组织中miR-520b和IL-2的表达显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(均

<0.05)。

2.2 肝癌组织和癌旁组织中IL-2的表达 见图2。相比于癌旁组织，肝癌组织中IL-2表达显著下降，差异有统计学意义(

<0.05)。

1.3.4 检测细胞增殖率、细胞凋亡率及迁移实验中IL-2的表达水平 以MTT检测细胞增殖率；流式细胞术检测细胞凋亡率；western blot检测迁移实验中IL-2的表达水平。

1.3.1 细胞培养及转染 细胞分为miR-520b过表达组(简称过表达组)、空白对照组和对照组。常规方法复苏HepG2细胞，根据Lipofectamine

2000说明书将miR-520b mimics及miR-NC质粒转染至过表达组和空白对照组细胞中，对照组细胞不进行转染。转染48 h后，将重组IL-2添加到3组细胞中最终浓度为4 mu/L培养24 h。用qRT-PCR法检测转染效率，转染成功后用于后续实验。

1.3.6 检测miR-520b对肝癌细胞药物敏感性的影响 按每孔1×10

个密度将HepG2细胞接种于6孔板中，分为对照组、过表达组、药物组(IL-2)、药物混合组(IL-2+miR-520b)。对照组细胞不做处理，过表达组和药物混合组细胞转染miR-520b mimics，细胞转染后培养24 h，将IL-2添加到药物组和药物混合组细胞中，最终浓度4 mu/L，继续培养12 h，采用MTT法测定细胞增殖率。

如果地方官员或者企业负责人行为构成违法或者犯罪，为了掩盖自己的违法犯罪事实，主动支付费用，这种行为就不构成敲诈勒索，因为批评者发表的文章是建立在客观事实基础之上的，是公民行使监督权的具体表现。如果地方官员或者企业负责人迫于压力，担心自己的名誉或者信誉受到影响，不得已向批评者支付费用，那么，这种行为属于敲诈勒索。我国刑法第274条规定，敲诈勒索公私财物，数额较大的，处三年以下有期徒刑、拘役或者管制；数额巨大或者有其他严重情节的，处三年以上十年以下有期徒刑。

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2.6 miR-520b对IL-2处理后的3组细胞增殖率和凋亡率的影响 见表1。

2.7 miR-520b对IL-2处理后的3组细胞迁移和侵袭的能力影响 空白对照组与对照组比较，细胞转移活性和侵袭性无显著差异，过表达组细胞转移活性和侵袭性低于对照组和空白对照组(

<0.05)。见图6、7。

2.8 miR-520b对IL-2处理后的4组细胞药物敏感性影响 见图8。过表达组细胞与对照组比较，无显著差异，药物组细胞增殖率低于对照组，药物混合组细胞增殖率较药物组和过表达组均显著下降(

<0.05)。

3 讨论

肝癌的发生发展是长期复杂的过程，它是一个多基因相关的疾病，因此采用基因靶向治疗，从分子机制的角度探索治疗方法是当前肝癌治疗的研究热点。microRNA与癌症发生和发展关系密切，可对癌细胞生长、凋亡、迁移、侵袭产生影响，同时具有促癌和抑癌双重作用影响肿瘤的进展

。miRNA在依赖于特定组织类型的特定调控网络的细胞中具有不同的功能，研究表明，miR-520b是头颈癌中的一种多功能肿瘤抑制因子

，也被证明是抑制乳腺癌、肺癌、脊柱骨肉瘤和胶质瘤中细胞生长或迁移的肿瘤抑制因子

。IL-2是重要的T细胞生长因子，具有多种生物学功能，是维持机体正常免疫功能的关键因子，在几乎所有肿瘤中都有表达，并对肿瘤细胞增殖和凋亡具有重要影响

。本研究中miR-520b和IL-2在肝癌组织表达均显著降低，在转染miR-520b后的肝癌细胞中miR-520b、IL-2的表达水平均增加，提示在肝癌环境下miR-520b与IL-2与肝癌的发生发展存在联系，这与miR-520b在其他肿瘤中的表达结果具有一致性。同时我们推测miR-520b可能对IL-2存在一定的调控作用，但机制尚不清楚。

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控制癌细胞的增殖，促进其凋亡是治疗癌症的主要思路。研究显示，miR-520b对癌细胞的增殖和凋亡可产生影响，低表达的miR-520b可促进肿瘤细胞增殖，过表达的miR-520b 可抑制肿瘤细胞增殖

，miR-520b也可通过上皮-间充质转化机制抑制细胞迁移和侵袭

。还可通过靶向CD44调节肿瘤干细胞转化来抑制头颈癌的恶性程度

，而不同剂量的miR-520b可明显降低肺癌A549细胞中HDAC4的表达，miR-520b抑制剂可增强肺癌细胞中HDAC4的表达

。IL-2具有刺激T细胞增殖和分化，促进B细胞增殖及分泌抗体等功能

。肿瘤患者通常伴随免疫功能的降低，表现为IL-2等免疫因子分泌减少，研究显示IL-2在膀胱癌、肝癌等多种癌症中表达降低

。本研究中利用TargetScan软件预测miR-520b与IL-2的结合位点，并通过荧光素酶报告基因实验结果发现在肝癌细胞中上调miR-520b的表达后，可明显抑制野生型IL-2的3′UTR的荧光素酶报告基因的表达，提示miR-520b可对IL-2进行直接调控，IL-2可能是miR-520b的靶基因，推测可通过增强miR-520b的表达来调控IL-2对肝癌实施治疗。Western blot的结果提示miR-520b可能调控了IL-2表达。而转染miR-520b后的结果，提示miR-520b可能通过靶向IL-2影响了肝癌细胞的生长率、凋亡率、细胞迁移和侵袭。这与以往结果具有一致性。

miRNAs在癌症耐药的发生中也起着不可忽视的作用。有研究显示，miR-520b可使细胞对治疗药物和辐射敏感

，其可调控乳腺癌细胞的耐药性

。在细胞实验使用IFN-α2a、GM-CSF、 IL-2 等3种因子组合处理肝癌细胞后可抑制细胞的增殖活动

。本研究中，经IL-2处理后的肝癌细胞在转染了miR-520b后，细胞增殖率降低，凋亡率增加，转移和侵袭能力均显著降低，提示miR-520b可增强抑制肝癌细胞的增殖活动，与以往研究结果相符。进一步的药物敏感性实验显示，miR-520b联合IL-2较单独采用miR-520b以及单独使用IL-2对肝癌细胞活动的抑制作用更明显，提示miR-520b可能通过调控IL-2影响肝癌细胞生长、转移、侵袭等活动，从而影响药物敏感性。

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