基于16SrRNA技术探讨轻微型肝性脑病患者肠道菌群的变化特征*

轻微型肝性脑病(MHE)是以行为异常和意识障碍等为特征的中枢神经系统(CNS)功能失调综合征，一般由肝功能障碍和(或)门体分流，使内源性或外源性毒性代谢产物，未经肝脏的代谢清除，导致全身代谢紊乱，属于肝性脑病(HE)早期阶段。MHE的早期发现和有效干预措施是治疗的重点。近年研究表明，肠道微生态改变与肝脏疾病的发生发展密切相关

，并且有可能加快MHE患者病情的进展

，而有效地干预和控制肠道菌群失调有利于延缓和阻止肝脏疾病的发生发展

。本研究通过16S rRNA 技术分析MHE患者肠道菌群丰度及结构变化，为MHE的预防和治疗提供理论依据及思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入广西中医药大学第一附属医院肝病专科诊断符合乙型肝炎后肝硬化标准、并发MHE的16例患者为研究对象，另从社会招募10例健康志愿者作为对照组。对照组人员均为健康体检者，通过病史、体格检查及胸透、血尿常规、血糖、肝、肾功能等理化检查，评定无心、脑、肝、肾、肺等主要器官系统的实质性病变。在纳入的16例MHE患者中，女6例，男10例，年龄(51.46±8.38)岁。对照组10例，女4例，男6例，年龄(48.26±11.52) 岁。两组人员在年龄、性别方面比较，差异均无统计学意义(

>0.05)。课题研究报广西中医药大学第一附属医院伦理委员会审查，批准后实施(伦理编号2018-002-01)。严格按本研究知情同意操作规范进行知情告知。

（2）铸件验收标准 铸件材质为G20Mn5+N，是目前轧机机架广泛使用的材质之一，其化学成分要求如附表所示。

1.2 诊断标准

图4为MFAC-PID和PID仿真比较结果。从图4可见： 在设定值阶跃响应阶段，PID串级控制算法的调整时间为350 s，其超调量约为50%；MFAC-PID串级控制算法的调整时间为250 s，其超调量为30%。在蒸汽扰动阶段，PID串级控制算法的调整时间大于400 s，其超调量高达170%；MFAC-PID串级控制算法的调整时间约为250 s。在给水扰动阶段，PID串级控制算法的震荡回复时间约为250 s，其超调量约为20%；MFAC-PID算法的调整时间为200 s，其超调量为10%。

2.6 差异肠道菌群的微生物群落代谢分析 PCA分析发现，MHE组样本主要集中在转录因子、转运蛋白、分泌系统、转运体4个方面(见图6)。

1.2.2 患者纳入标准 ①符合上述诊断标准；②肝硬化Child-Pugh分级均为A或B级；③数字连接试验(NCT)及数字符号试验(SDT)同时或其中1项异常者。

2.4 肠道菌群差异的关联统计分析 我们进行了Spearman分析，将相互拮抗或协同的物种信息通过网络构建出来(见图4)。其中肠球菌属与瘤胃球菌属、青枯菌属与布劳特氏菌属、考拉杆菌属与放线菌属呈显著的负相关关系。

2.3 MHE患者肠道菌群差异在门、纲、目、科、属水平分类学组成分析 根据物种注释结果，在门的水平两组样本间具有统计学差异的菌属为厚壁菌门和变形菌门；纲水平主要是梭菌纲、红蝽菌纲和杆菌纲；目水平有乳杆菌目、梭菌目、放线菌目和红蝽菌目；科水平为毛螺菌科和红蝽菌科；属水平则为罗斯伯里氏菌属、毛螺菌属、粪球菌属和韦荣球菌属(均

<0.05)。为了更加深入探索MHE患者肠稳态菌属，我们将属分类水平丰度排名前15的OTU也排列出来，分别有拟杆菌属、肠球菌属、粪杆菌属、布劳特氏菌属、韦永氏球菌属、巨单包菌属、肠杆菌属、毛螺菌属、罗斯氏菌属、普氏菌属、乳酸菌属、瘤胃球菌属、芽殖菌属、粪球菌属、链球菌属。见表1。

2.2 MHE患者肠道菌群差异的Beta分析 见图3。与Alpha分析一致，两组样本肠道微生物组成结构存在显著性差异(

=0.002，

<0.01)。

2 结果

2.5 差异肠道菌群的微生物群落功能分析 见图5，表2。可以看出两组样本在预测功能上存在差异，其中在染色体、氨基酸相关酶、甲烷代谢、精氨酸和脯氨酸代谢功能上存在统计学差异(

<0.05)。

Analysis of the Present Situation and Existing Problems of Dianchi Wetland Park——A Case Study of Wujiadui Wetland Park________________________LI Yuntao 28

1.4 统计学方法 所有数据以平均值±标准差表示。采用

法进行方差齐性检验，正态分布资料的相关性采用

相关系数，使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。以

<0.05表示差异有统计学意义。

那个全秃的亮头皮的妇人在对面的长炕上类似尖巧的呼叫，她一面走到金枝头顶，好像要去抽拔金枝的头发。弄着她的胖手指：

1.3 研究方法 采用Invitrogen DNA Mini Kit提取肠道宏DNA，使用荧光计仪对DNA进行定量，E-Gel 电泳系统检验核酸完整性。对DNA进行16SrRNA扩增与纯化，具体操作根据Gillevet和Hamady相关实验方法

；KEGG代谢路谱分析是在QIIME软件中以97%相似性水平上挑选OTU序列，输出脚本，使用PICRUSt软件在KEGG通路水平输出代谢功能丰度。

2.1 MHE患者肠道菌群差异的Alpha分析 见图1。图1显示(Control组表示对照组，treatment B/treatment before组为MHE组，下同)，随样本量增加，两组样本Alpha曲线趋于平缓，表明样本量已足以反映物种群落的丰富度等变化情况。但对照组样本曲线达到反映该物种群落的丰富度所需要的测序深度较MHE组高，说明MHE组样本物种的丰富程度较低。就微生物群落而言，MHE组样本Chao1指数与Shannon指数均显著降低(

<0.01)，说明MHE组样本肠道微生物群落丰富度和多样性显著减少；另外MHE组样本Shannon箱型图个体间离散程度较对照组明显，提示MHE组样本肠道菌群结构个体差异较大，见图2。

1.2.1 乙型肝炎后肝硬化诊断标准 16例患者诊断符合中国中西医结合学会消化系统专业委员会制定的肝硬化中西医结合诊疗共识中的标准

。

3 讨论

肝脏作为人体最大的代谢器官，通过将胆汁酸释放到胆道和全身与肠道沟通循环。而在肠道中宿主和肠道菌群代谢内源性和外源性产物通过食道静脉支流被带入肝脏门静脉，由此肠-肝双向关系形成。一个完整的“肠-肝-脑轴”依赖于稳定的肠道粘膜屏障、健康的肠道菌群以及正常的肝脏功能，原因第一是肠道上皮细胞可形成物理屏障阻碍细菌侵入肠道黏膜，作为连接天然免疫与适应性免疫应答的桥梁

；第二是当屏障破坏后，肝脏不仅是肠道逃逸细菌的被动接受者，而是能积极控制它们进入体循环的途径

，所以肠道菌群与肝脏疾病有着紧密关系。虽然己知肠道微生态对控制MHE进程有重要作用，但是具体的作用机制及相关菌群结构、功能和代谢变化仍不完全清楚。

本研究发现，在门的水平对照组样本粪便菌群中绝大多数序列隶属于拟杆菌门和厚壁菌门，两菌门序列约占总序列数90%，是肠道菌群中的绝对优势菌。与对照组相比，MHE组患者厚壁菌门细菌比例显著减少，差异主要来自隶属于厚壁菌门中的梭菌纲和杆菌纲；进一步分析发现毛螺菌科中罗斯氏菌属、毛螺菌属、粪球菌属相较于对照组明显降低，而韦荣球菌属细菌较对照组却显著升高。其中韦荣球菌属为MHE的潜在致病菌，属于人类口腔定植菌之一，可沿着消化道异位定植到肠道后发挥协同作用，诱发加重肝性脑病病情

。研究发现其致病过程主要是通过发酵乳酸引起的 pH 降低导致丁酸的生长速率受抑，间接促进肠黏膜促炎细胞因子表达并产生内毒素影响肠道免疫

；同时通过增加氨的产生导致细微或明显的肝性脑病，使患者认知能力下降，MELD评分升高

；不仅如此，还发现它的增加与体内内皮激活和胆汁代谢有关

。而在属水平排名前15中的差异菌群中肠球菌属也为MHE潜在致病属，其中肠球菌属在MHE患者肠道粘膜含量升高和克雷伯氏菌属肝硬化患者粪便含量升高已被实验所证实

；同时肠球菌属和肠杆菌属是与体内炎症感染相关的病原菌，其炎症反应可能开启血脑屏障导致毒素进入大脑，这与大多数MHE关系密切

。毛螺菌属、罗氏菌属、粪球菌属的作用则与韦荣球菌属呈相反态势，它们被称为有益菌属，主要参与丁酸盐的产生

。相关研究证实毛螺菌属、罗氏菌属、粪球菌属可通过将碳水化合物分解为短链脂肪酸(SCFAs)的方式参与丁酸盐的产生，进而抑制肝脏中的胆固醇及低密度脂蛋白的生物合成

；而丁酸盐是上皮细胞的主要能量来源，可通过调节肠道pH、抑制核因子信号通路、促进黏蛋白和抗菌肽的产生，同时通过增强肠上皮细胞的完整性来增强肠屏障功能，减少促炎因子及细胞黏附分子的表达

。相关证据显示

，这3种肠道菌属与肠道氨水平、体内相关炎症和内皮激活呈负相关，而与良好认知能力、肠道IgA水平和肠道免疫力呈正相关，对肝性脑病的发展有很好的抑制作用。在前15种差异菌属中粪杆菌属、布劳特氏菌属也皆与丁酸盐的正常产生相关。另外，隶属于放线菌门的红蝽菌纲、红蝽菌目、红蝽菌科升高具有统计学意义。其中红蝽菌与多不饱脂肪酸、血清胆固醇和甘油三酯代谢密切相关，表明该菌属变化可能与MHE患者内源性脂质代谢有关

。

由此可见，民间俗信作为一种流动的生活文化现象，它是一种以民众为主体在进行着动态的传承，故其内涵与象征意义必然会受到不同时代人们的生活形态、信仰心理的影响，而有所质变。张光直在讨论神话与当代文化社会关系时曾经说过：

后续的物种相互关联分析我们发现存在相互抑制信息的菌属，其中肠球菌属与瘤胃球菌属之间负相关关系符合我们之前的讨论，它们在丁酸盐的产生上呈相反作用；青枯菌属和放线菌属在肠道内多数易引起感染，促进炎症反应发生，而与其呈负相关的布劳特氏菌属和考拉杆菌属则能发挥抗炎作用，与全身性炎症细胞因子显著相关

。所以我们推测在MHE患者肠道中肠球菌属、青枯菌属和放线菌属可能导致肠道丁酸盐产生下降、氨水平上升和炎症反应来诱发MHE的发生，而与其呈相互抑制的菌属有望成为治疗的切入靶点。另外，KEGG预测群落功能显示在染色体、氨基酸相关酶、甲烷代谢、精氨酸和脯氨酸代谢功能上存在显著差异，表明MHE发生、发展进程可能与其肠道菌群功能变化存在关系；进一步KEGG PCA分析中我们发现MHE组样本在转录因子、转运蛋白、分泌系统、转运体4个方面差异的贡献值较高，提示MHE患者肠道菌群代谢途径可能通过这4个途径参与MHE发病。

综上所述，MHE患者存在菌群结构失衡的主要特征为在门、纲、目、科、属中有益菌减少、致病菌增长以及肠道内各菌属之间的比例失调，功能主要是在染色体、氨基酸相关酶、甲烷代谢、精氨酸和脯氨酸代谢上存在差异，并且可能通过转录因子、转运蛋白、分泌系统、转运体等途径参与MHE发病。新近多数研究表明肠道菌群微生态与肝性脑病的发生、发展和控制有着密切关系，失调的菌群通过移位、加重炎症反应和内毒素水平等促进MHE的病理进展过程，最后导致患者认知水平和MELD评分加重。所以本研究发现的结构和功能失调菌属以及菌属相关代谢信息可作为MHE患者肠道菌群失衡状态及进展风险的有效评估项目，为MHE的治疗提供新的方向和依据。但同时该研究也存在不足，首先是未能将MHE疾病进展分期与肠道菌群多样性、结构和功能代谢进行比对；其次是组间结构和功能差异菌属虽然可能是导致MHE的关键菌属，但并不代表所包含菌属都对MHE的肠道群落结构和功能产生影响，简而言之，细致到每个菌属在MHE疾病层面具体的作用机制还有待更加深入全面的研究。

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