舒肝宁注射液对非酒精性脂肪性肝病组织工程肝保护作用的机制研究*

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲喂条件 SPF级实验用健康成年雄性大鼠，体重200～250 g，购自维通利华实验动物技术有限公司。室温约23℃，湿度70%，常规消毒饲料和饮用水，自由进食。本实验研究方案经由北京佑安医院实验动物伦理委员会审批(批号：AEEI-2020-076) ，符合实验室动物管理与使用准则。

1.2 主要仪器生物分光光度计(美国 IMPLEN 公司)，多功能酶标仪(美国 Thermo Fisher 公司)，蠕动泵(美国 Masterflex,thermo fisher 公司)等。

1.3 实验试剂 DMEM培养基、RPMI-1640培养基(上海Hyclone公司)，胎牛血清、青霉素/链霉素(美国Gibco公司)，0.25%胰酶、SDC粉剂、磷脂酶A2、油酸、棕榈酸(美国sigma公司)，CCK-8检测试剂盒(东仁化学科技(上海)有限公司)，蛋白质定量试剂盒、线粒体膜电位Jc-1检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所，MDA检测试剂盒、ROS检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；舒肝宁注射液(2 ml/支)由贵州瑞和制药有限公司提供。

1.4 方法

1.4.7 免疫荧光染色组织工程肝研磨的细胞，PBS洗涤，4%的多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100透化，5% BSA室温封闭，加一抗(小鼠抗人ATP5A，Thermo公司)4℃过夜，PBS清洗后二抗(羊抗小鼠TRITC标记，索莱宝公司)避光孵育1 h，95%甘油封片拍照。

1.4.2 细胞毒性检测(CCK-8法) 在96孔板中每孔加入100 μl的人HepG2细胞悬液(40～60个/μl)。孵育24 h后向96孔板加入不同稀释浓度的舒肝宁注射液，作用24 h后每孔加入10 μl CCK溶液，在培养箱内孵育20 min，用酶标仪测定450 nm处的吸光度来计算细胞毒性。

1.4.3 原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡组织工程肝研磨的细胞或冰冻切片用500 μl 4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤，2% Triton 破膜后，再次PBS洗涤，加上50 μl TUNEL染液37℃避光孵育60 min，洗涤后用荧光分光光度仪检测或荧光显微镜观察分析。

1.4.4 细胞丙二醛(MDA)检测用细胞刮将细胞刮下加试剂60 μl+样品60 μl，混匀，将细胞破碎制成悬液，取样0.1 ml按操作表配好试剂，混匀，95℃以上水浴，冷却，离心，波长530 nm多功能酶标仪测定各孔吸光度再计算。

命题人在选项中常常故意颠倒因果或无理地构建推理，因此考生要将选项内容与原文逻辑仔细核对，看看是否有出入。比如《中国古代星宿》一文，第三题的题干是“根据原文内容，下列理解和分析不正确的一项是（）”，该题C项“北斗七星像一个巨大勺子的形状十分醒目，地位十分重要，也是我们最熟悉的星宿之一”就犯了强加因果的错误，而原句是“北斗七星的地位一天比一天高起来，后来成了掌管人们生死的星宿”。

2.5 舒肝宁注射液对TEF肝脏肝细胞线粒体的保护作用 ATP5A是线粒体ATP合成酶的重要组成部分。下图中红色荧光为ATP5A阳性细胞，代表线粒体活性，FFA组ATP5A降低时红色荧光少，说明线粒体活性差；蓝色荧光是DAPI染色的细胞核。舒肝宁注射液组ATP5A阳性细胞明显增加，提示线粒体活性增强(图5)。对线粒体膜电位(MMP)进行了JC-1荧光染色定量检测，发现舒肝宁注射液组MMP明显高于FFA组(图5C)(

<0.05)。ccc-P为线粒体电子传递链抑制剂，是诱导线粒体膜电位(MMP)下降的阳性对照。

1.4.1 组织工程肝脏的制备采用灌注法将SD大鼠肝脏去细胞化制为肝脏胶原支架，将人HepG2细胞种植到肝源性基质支架中，建立与NAFLD患者肝脏平行的TE脂肪(TEF)肝模型，并用含500 μmol/L游离脂肪酸(油酸：棕榈酸=2∶1)的高脂培养液培养8 d后检测各项指标。人HepG2在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中培养。每隔2～3 d进行一次细胞传代。制备了游离脂肪酸(FFA)，并将其作为脂肪补充培养基。油酸(OA)和棕榈酸(PA)按2∶1比例用100%乙醇溶解，加入氢氧化钠和DMEM 混合均匀，60℃超声浴30 min。最后加入无脂肪酸牛血清白蛋白，用浓盐酸调节至pH7.4并过滤除菌。正常完全培养液(DMEM+10%胎牛血清)和高脂培养液分别建立组织工程肝(TE)和组织工程脂肪肝(TEF)模型。每天更换培养基。再细胞化5 d后，分别用不同稀释浓度舒肝宁(10

～10

)处理3 d。伊红染色(HE)进行肝细胞组织病理检查。

目前，云天化集团及下属企业正进一步主动融入和服务国家“一带一路”倡议，主动融入沿线国家相关产业发展，积极参与“孟中印缅经济走廊”和“中南半岛”建设。一是构建面向全球资源配置的贸易平台，对于进口原料，除巩固进口传统区域外，还积极发力哈萨克斯坦、土库曼斯坦等“一带一路”沿线区域；二是构建具有区域竞争优势的海外营销体系，在越南、缅甸等“一带一路”沿线国家设立分子公司，推动企业国际化发展；三是充分发挥天川滙外贸综合服务平台作用，为云南乃至全国中小微企业提供全方位的“一站式”外贸综合服务。

2 结果

2.1 细胞毒性用普通平皿培养的细胞检测舒肝宁注射液的细胞毒性，发现加入不同稀释度舒肝宁注射液，从10

到10

舒肝宁注射液对细胞均无明显的细胞毒性，提示其安全性良好(图1)。

1.4.5 活性氧(ROS)检测组织工程肝研磨的细胞重悬，再加入0.5 μl DCFH-DA，混匀后孵育、洗涤、离心。用荧光分光光度仪检测分析。

2.2 肝脏病理组织学检查 TEF肝脏出现细胞质疏松化、细胞水肿、气球样变、核皱缩、核溶解等病理改变。舒肝宁组细胞坏死明显减少(图2)。

根据深层地热资源勘探工程NS-A地热井施工组织设计的设计要求及对组合测井资料的综合分析，经综合研究分析，确定该地热井取用中新统红柳沟组下部及渐新统清水营组级石炭系上部热储，确定取水段为1594.75～3167.11 m。止水位置确定在1555.84～1558.31 m、1559.11～1571.58 m。

2.4 氧化应激检测加入10

的舒肝宁注射液后，细胞内的ROS、MDA水平明显降低。(图4)。

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡加入10

的舒肝宁注射液可见TEF肝组织中绿色荧光细胞减少(提示细胞凋亡减少)，提示舒肝宁注射液对FFA引起的肝细胞损伤有保护作用(图3)。用荧光酶标仪进行定量检测，发现两组平均荧光强度(MFI)差异有统计学意义(图3C)。

面向日益复杂多样的环境问题，西方传统科学逐渐形成环境科学群，包括环境自然科学和环境社会科学两大类别。McNeill[8]9曾说：“环境涉及的学科之多，达到了知识追求所能达到的地步。”话语理解的多向度本质和环境科学群的形成决定了环境话语理解的多向度本质和环境话语研究的多学科向度。环境话语研究主要关涉的环境分支学科有生态语言学、环境社会学、环境传播学、环境政治学、环境地理学、环境史学等。

1.4.6 线粒体膜电位(MMP)检测配制工作液、细胞悬液，充分混匀后在37℃避光孵育20 min。离心4 min，JC-1染色缓冲液洗涤，用适量JC-1染色缓冲液重悬后，用荧光分光光度仪检测分析。

在新时代机遇与挑战并存背景下，广东瑞丰生态环境科技股份有限公司专注土壤修护事业，走出了属于自己的发展之路。为了共商土壤修护大计，构建基层土壤修护服务模式，共同推进绿色生态文明建设，11月18日，“千秋伟业激昂前行”中国首届基层土壤修护服务体系发展论坛暨2018瑞丰生态（集团）第五届“未来之星”VIP客户联盟财富峰会在安徽黄山召开。

3 讨论

NAFLD是目前最常见的慢性肝病之一，发病机制不明。本研究采用灌注法将SD大鼠肝脏去细胞化制为肝脏胶原支架，将人HepG2细胞种植到肝源性基质支架中，建立了与NAFLD患者平行的TE脂肪(TEF)肝模型。去细胞方法采用的是军事科学院王韫芳团队的SDC/PLA2四步法

，该方法能在短时间内完成肝脏的去细胞化，可以最大限度的保持肝脏的脉管系统以及细胞外基质成分等。该支架是细胞移植的支撑和运输营养物质及氧分的重要基础。该去细胞支架保留了>95%的胶原、黏附分子、弹性蛋白、蛋白多糖等。通过新型组织工程肝脏循环灌注高脂培养基，本研究组前期研究对该模型进行了代谢、转录和表型等测定，结果表明成功获取了体外NAFLD模型

。

有研究证实氧化应激在NAFLD的病理生理过程中起重要作用，但相关机制研究较少。本研究通过建立FFA诱导体外的NAFLD模型，用舒肝宁注射液干预后进行细胞凋亡、氧化应激等相关指标检测，CCK-8检测提示舒肝宁注射液浓度从10

到10

均无明显的细胞毒性，安全性良好；Tunel试验提示舒肝宁注射液可抑制FFA引起的细胞凋亡，同时可降低TEF肝脏MDA、活性氧(ROS)来抑制氧化应激反应减轻FFA诱导的NAFLD从而发挥肝脏保护作用。线粒体缺陷可能是NAFLD发生发展的基础，因为它改变了能量稳态，刺激ROS的产生，从而导致氧化应激和脂肪氧化。脂肪氧化的增加会产生过量的ROS，ROS与细胞结构发生反应，进而导致脂质过氧化和DNA氧化损伤，这是细胞氧化应激的经典标志。细胞一旦出现氧化应激，会启动细胞凋亡。因而，NAFLD被认为是一种线粒体疾病。MDA是脂质氧化的终产物，会引起蛋白质、核酸等的交联聚合，具有细胞毒性。ROS、MDA都可直接造成细胞损伤, 最终导致肝脏炎症、纤维化和癌症

。

许钧称他在法国留学生涯中被法国语言文学的美深深吸引，这让他看到了文学翻译存在的意义，他希望和更多的中国读者一起分享这种美的享受。他认为“文学翻译有其特殊性。文学，是文字的艺术，文化的一个组成部分，而文字中，又有文化的沉淀。文学翻译既是不同语言的转换活动，也是一种艺术再创造活动，同时也是一项跨文化的交流活动。”[9]

线粒体作为能量生产场所，是自由基、ROS衍生的主要部位，同时又可能是ROS攻击的主要靶点。细胞呼吸关键蛋白三磷酸腺苷合成酶亚单位α(ATP5A)是ATP合成酶的一个亚单位，是氧化磷酸化(OXPHOS)的关键酶，ATP5A活性可能在细胞的能量生产中发挥重要作用。过量的脂肪通过改变OXPHOS的功能和减少ATP的产生来干扰能量代谢。线粒体氧化磷酸化缺陷可导致 ATP 产生减少和 ROS 产生增加。FFA可能通过降低OXPHOS活性来减少超氧化物歧化酶的产生。ATP5A降低暗示了细胞对氧化应激的反应机制。FFA和氧化应激诱导后，OXPHOS和ATP的生成减少

。舒肝宁注射液可能通过ATP5A抑制氧化应激减轻FFA诱导的NAFLD。

新型组织工程肝为NAFLD的研究提供了一个很好的平台，但本研究尚存在一定局限性，首先动物实验并不能完全模拟真实的人体内环境，单独的人HepG2细胞不能模拟完整肝脏的多细胞环境。下一步研究将开发包括星状细胞和Kupffer细胞，在微流控装置内灌注葡萄糖、胰岛素和炎症细胞因子，可以更好反映NAFLD的转录、细胞信号和病理生理变化，包括糖异生、氧化应激、炎性和纤维化细胞因子的产生以及星状细胞的激活。

[1] Oliveira CP, Cotrim HP, Stefano JT,

. N-acetylcysteine and/or ursodeoxycholic acid associated with metformin in non-alcoholic steatohepatitis: an open-label multicenter randomized contyolled TRIAL[J]. Arq Gastroenterol,2019,56(2):184-190.

[2] Lebeaupin C, Vallée D, Hazari Y,

. Endoplasmic reticulum stress signalling and the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol,2018,69(4):927-947.

[3] Akazawa Y, Nakao K. To die or not to die: death signaling in nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Gastroenterol,2018,53(8):893-906.

[4] Safari Z, Gérard P. The links between the gut microbiome and non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)[J]. Cell Mol Life Sci, 2019,76(8):1541-1558.

[5] Bachi A, Dalle-Donne I, Scaloni A. Redox proteomics: chemical principles,methodological approaches and biological/biomedical promises[J]. Chem Rev,2013,113(1):596-698.

[6] Klaunig JE, Kamendulis LM, Hocevar BA. Oxidative stress and oxidative damage in carcinogenesis[J]. Toxicol Pathol, 2010,38:96-109.

[7] Esser N, Legrand-Poels S, Piette J,

. Inflammation as a link between obesity, metabolic syndrome and type 2 diabetes[J]. Diabetes Res Clin Pract ,2014,105:141-150.

[8] 梁海雄，黎丽群.舒肝宁注射液治疗慢性乙型病毒性肝炎临床研究Meta分析[J].世界中西医结合杂志,2016,11(8):1057-1062，1066.

[9] 郑勇凤，王佳婧，傅超美，等.黄芩的化学成分与药理作用研究进展[J].中成药,2016,38(1):141-147.

[10] Turner R, Lozoya O, Wang Y,

. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology[J]. Hepatology,2011;53(3):1035-1045.

[11] Qiao W,Juan L, Lijin L,

. Establishment of an ex vivo model of nonalcoholic fatty liver disease using a tissue-engineered liver[J]. ACS Bio Sci Engineer, 2018,4(8): 3016-3026.

[12] 张译之，段钟平，张晓慧，等．肝爽颗粒对新型组织工程肝脏非酒精性脂肪性肝病大鼠模型脂代谢的影响[J]．临床肝胆病杂志，2020，36(7):1551-1555.

[13] Chienwichai P, Reamtong O, Boonyuen U,

. Hepatic protein Carbonylation profiles induced by lipid accumulation and oxidative stress for investigating cellular response to non-alcoholic fatty liver disease in vitro[J]. Proteome Sci, 2019,17:1.