基于网络药理学探讨丹参饮治疗扩张型心肌病的作用机制

何轩辉，陈恒文，谭雨晴，2

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)主要特征是左心室或双心室扩张和收缩功能受损，且不同于异常负荷状态(如高血压和瓣膜性心脏病)或冠状动脉疾病[1]。扩张型心肌病病因复杂，可大致分为遗传型和非遗传型，遗传型的涉及编码细胞骨架、肌节等基因突变；非遗传型包括感染引起的心肌炎、不良接触(如药物、酒精、毒素)以及代谢、免疫、内分泌紊乱等[2]。扩张型心肌病常导致充血性心力衰竭，但也可能出现循环衰竭、心律失常、血栓栓塞甚至猝死[2-3]。扩张型心肌病临床治疗主要以改善心功能、减轻症状为主，应该针对根本原因实施个体化治疗，恢复心功能，逆转心肌重塑[4]。中西医病证结合治疗扩张型心肌病，可以增强心肌收缩功能，提高射血分数，逆转心室重构，且可提高病人生活质量，改善预后[5]。中医认为，心阳不足、气阴亏虚与痰、湿、寒、瘀等交互作用，从而出现胸闷胸痛、心烦气短、咳嗽气促等症状，与《灵枢》《素问》《备急千金药方》等所记载的“心胀”“心痹”相似。《黄帝内经》言：“人之所有者，血与气耳”，运用中医药治疗扩张型心肌病也应气血同调。

丹参饮出自《时方歌括》，由丹参、檀香、砂仁组成，原方广泛运用于治疗气滞血瘀的心胃痛诸症[6]。有研究结果显示，治疗扩张型心肌病的中药方中，丹参饮使用频率较高[7]。临床多用降香代檀香，丹参倍用，为君药，《本草纲目》记载丹参有活血之功效，可通心包络，亦补亦泻，气行则血行，气滞则血瘀，故配伍降香和砂仁，降香入气分，辛香走窜，温通行滞，又入血分，可散瘀止痛，善通血脉。《雷公炮制药性解》记载砂仁可主腹痛、心疼，咳嗽喘满。辛、温之性味善于行气和胃化湿，补中伏土，正所谓“温升其肝脾，清降其肺胃”。三味药物配伍相宜，气血同调，攻补兼施，可行气滞、通血瘀、止定痛。

中医药治疗扩张型心肌病优势显著、疗效稳定、安全耐受，在改善心脏收缩舒张功能及逆转心室重构等方面具有巨大的潜能，然而其发挥心血管保护作用的药物成分、干预靶点、作用途径不甚明确。网络药理学可以基于多学科交叉整合关联药物-成分-靶点-疾病的网络机制，本研究采用这一方法从不同层面、多个靶点、多种途径分析丹参饮干预扩张型心肌病的潜在机制，为临床研究及机制研究提供依据，为后续中医药治疗扩张型心肌病的经典传承、机制研究、新药研发、靶向化治疗提供思路及理论基础。

1 资料与方法

1.1 丹参饮主要活性成分及靶点筛选 通过中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)查找丹参饮中三味药物的化学成分，临床檀香多用降香代替，故检索丹参、降香、砂仁，根据毒药动力学(ADME)值中的口服利用度(OB)≥30%及类药性(DL)≥0.18筛选获得药物主要活性成分，结合中药药典进行补充，并利用TCMSP获取化合物的靶点信息，利用UniProt数据库对化合物靶点信息进行规范化处理。

1.2 扩张型心肌病靶点筛选 查找GeneCards数据库及OMIM数据库中与疾病相关的靶点，设定检索词为“dilated cardiomyopathy”，GeneCards数据库中relevance score参数值表述靶点与疾病相关度，数值与相关度成正比，根据相关度筛选，合并两个数据库的疾病靶点信息，保留唯一值建立扩张型心肌病疾病靶点数据库。

1.3 丹参饮-扩张型心肌病靶蛋白相互作用(PPI)网络构建 合并丹参饮活性成分对应靶点数据库以及扩张型心肌病疾病靶点数据库，映射组建丹参饮-扩张型心肌病靶蛋白，采用Cytoscape 3.7.2软件，将化合物与潜在靶点的关系对应关联，形成“药物有效成分-潜在作用靶点”网络。将靶蛋白输入STRING数据库，完成筛选，构建PPI网络，最小互作阈值设定为中等置信度(medium confidence)，游离点无须隐藏，分析网络参数，确定蛋白互作关系中的关键点。

1.4 丹参饮-扩张型心肌病功能和通路富集分析 将丹参饮与扩张型心肌病的交集靶点导入DAVID 6.8平台，以P值条件筛选，对其进行基因本体(gene ontology，GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，通过潜在作用靶点参与的生物学途径，分析丹参饮发挥药理作用的主要信号通路及生物过程，探讨其治疗扩张型心肌病可能的作用机制。

2 结 果

2.1 丹参饮主要活性成分 初步筛查TCMSP中丹参饮中3味药物的化学成分，结合中药药典中对这3味中药主要成分的描述进行补充，增加了丹酚酸B、丹参酮Ⅰ、乙酸龙脑酯3个成分，其中丹参相关的活性成分67个、降香相关的活性成分37个、砂仁相关的活性成分11个，删除重复项后，共得112个化合物，详见图1。其中，poriferast-5-en-3beta-ol是丹参和砂仁共有的化合物， beta-sitosterol是降香和砂仁共有的化合物，OB最高的两种化合物为przewalskinb、(2R)-3-(3， 4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid；DL最高的2种成分为stigmasta-5，22-dien-3-beta-yl acetate、sitosteryl acetate。丹参饮部分化合物信息见表1。

图1 丹参饮主要成分韦恩图

表1 丹参饮部分成分基本信息

(续表)

2.2 丹参饮药物-主要活性成分-靶点网络 采用TCMSP获取活性成分相关靶点，UniProt数据库限定物种为“人”，校正靶点，得到丹参相关成分靶点130个，降香相关成分靶点71个、砂仁相关成分靶点50个，去除重复值后获得丹参饮药物靶点151个。采用Cytoscape 3.7.2绘制药物-主要活性成分-靶点图，有266个节点，1 490条边，不同药物可以有相同的成分，不同成分对应的靶点构成的网络机制错综复杂，一般对应多个靶点，图中活性成分取MOD ID后5位数字表示。详见图2。

图2 丹参饮药物-主要活性成分-靶点网络图

2.3 丹参饮治疗扩张型心肌病潜在靶点预测 在GeneCards检索扩张型心肌病相关的基因，根据Relevance score值筛选大于10，获取722个候选基因，OMIM数据库检索获得222个候选基因，将两个数据库获取的疾病靶点取并集，保存唯一值，最终获得891个疾病潜在靶点。与TCMSP数据库获得的活性成分相关靶点取交集，最终共同靶基因有44个，详见图3。利用Cytoscape 3.7.2对丹参饮活性成分治疗扩张型心肌病作用靶点的关系绘制网络图，涉及73个活性成分和345条边，节点度值(Degree)表示该节点在网络中的重要性，图形面积与度值成正比，结果显示：钠通道蛋白5型亚基α(SCN5A)、β2 -肾上腺素能受体(ADRB2)、雌激素受体(ESR1)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2(CHRM2)、肾上腺素受体α1D (ADRA1D)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)、内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)等靶点在网络中较重要。详见图4。

图3 丹参饮有效成分作用靶点及扩张型心肌病靶点交集韦恩图

图4 丹参饮有效成分治疗扩张型心肌病作用靶点网络图

2.4 丹参饮有效成分-扩张型心肌病靶点PPI网络构建 获取丹参饮和扩张型心肌病交集靶点44个，利用STRING 数据库分析交集靶点，构建丹参饮潜在靶点PPI网络，如图5所示。PPI网络图中有42个靶点发生相互作用，2个孤立的靶点，有447条边，平均度值为21.286，度值大于平均值的靶点蛋白有27个，排名较为靠前的为内皮素1(EDN1)、白介素6(IL6)、血管内皮生长因子 A(VEGFA)、低聚果糖(FOS)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生长因子受体(EGFR)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、白介素10(IL10)、NOS3，提示这些靶点蛋白可能在丹参饮治疗扩张型心肌病的过程中发挥关键作用。详见图5。

图5 丹参饮有效成分-扩张型心肌病交集靶点PPI网络图

2.5 丹参饮GO功能与KEGG通路富集分析 将丹参饮有效成分靶点与扩张型心肌病疾病靶点的交集输入DAVID数据库进行GO功能以及通路分析，以P<0.01进行筛选，获得生物学过程137项条目、细胞组分13项条目、分子功能22项条目，丹参饮主要涉及的细胞组分主要涉及质膜、细胞外间隙、胞外区等(见图6)；生物学过程包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正向调控、药物反应、凋亡过程的负调控等(见图7)；丹参饮调节扩张型心肌病的分子功能主要富集在蛋白质结合、细胞因子活性、蛋白质异二聚化活性等(见图8)。根据P<0.05筛选KEGG通路，得到77条通路信息，以基因数目降序，取前20位通路进行分析，结果见图9，显示丹参饮干预扩张型心肌病靶点基因主要富集于低氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、TNF信号通路、 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-磷酸激酶B(Akt)信号通路、恰加斯病(美洲锥虫病)、T细胞受体信号传导途径、钙信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号通路等。以P值取负对数，以颜色深浅表示显著性，富集基因数目与气泡面积成正比。

图6 丹参饮主要成分潜在靶点的细胞组成富集分析(前10位)

图7 丹参饮主要成分潜在靶点的关键生物过程富集分析

图8 丹参饮主要成分潜在靶点的分子功能富集分析

图9 丹参饮治疗扩张型心肌病的KEGG通路富集分析(前20位)

3 讨 论

本研究基于网络药理学研究，借助多个数据库、软件分析平台，建立了丹参饮-有效成分-作用靶点-扩张型心肌病网络模型，初步筛选后获得丹参饮有效成分112个，药物靶点151个，对丹参饮有效成分靶点网络简要分析发现，药物成分多样，不同药物成分可能有交叉，成分相对应的靶点也有不同。β-谷甾醇、木犀草素、丹参酮ⅡA、维斯体素、柚皮素等成分在网络图中联系密切，占据重要位置，可能是丹参饮治疗扩张型心肌病的潜在有效成分。研究表明，β-谷甾醇是一种天然的抗氧化剂，对氧化应激损伤具有保护作用[8]，可以促进线粒体产生活性氧生成三磷酸腺苷(ATP)，保护心肌[9]，增强阿司匹林的抗炎作用，且具有调节血脂、镇痛、免疫调节功能[10-11]。木犀草素具有抗炎、抗癌、抗氧化[12]、抗病毒[13]等药理特性，可以调节转录因子[如STAT3、核转录因子κB(NF-κB)[14]]，抑制白介素-8的产生，环氧合酶-2(COX-2)及NOS2的表达和一氧化氮(NO)的过度生成[15]，其利尿排钠作用可能与毒蕈碱型乙酰胆碱受体有关[16]。丹参酮ⅡA可通过雌激素受体介导激活蛋白激酶B并抑制Leu27IGF-Ⅱ诱导的心肌细胞中胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)受体信号激活的细胞凋亡作用，表明丹参酮ⅡA用于预防心肌细胞凋亡和心血管疾病的治疗，而不会增加患乳腺癌的风险[17]，且可以通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)-2信号通路抑制血小板活化，改善血液微循环，减轻脂质沉积，从而预防心脑血管疾病[18-19]。维斯体素通过干预中性粒细胞发挥抗炎作用[20]。柚皮素也具有广泛的药理活性，如抗病毒、抗氧化、抗炎、抗癌，可干预骨再生、代谢综合征、氧化应激损伤、中枢神经系统类疾病[21]。动物实验提示，柚皮素可上调沉默信息调节因子1(Sirt1)、过氧化物酶体增殖激活受体γ辅助激活因子α(PGC-1α)等蛋白表达，抑制PI3K/Akt/Sirt1信号通路，从而减轻心肌损伤，保护心脏[22]。

绘制丹参饮有效成分-扩张型心肌病网络图，进行度值分析，发现SCN5A、ADRB2、ESR1、NOS2、PPARG、CHRM2、ADRA1D、PDE3A、NOS3、MAPK14是网络中的关键节点，丹参饮可能通过作用于这些靶点发挥治疗作用。SCN5A参与编码心肌细胞电压门控Na+通道基因，SCN5A基因突变，导致离子水平失衡，与扩张型心肌病病因相关[23]。ADRB2与特发性扩张型心肌病相关，具有调节心率和心肌收缩的作用[24]，ADRB2过度甲基化诱导的β2肾上腺素能受体，抑制PI3K/Akt通路，进而导致心功能不全，ADRB2去甲基化可能是预防心脏损伤的新靶标[25]。ESR1不仅作用于生殖系统，对于心血管系统也有调节作用，ERK1/2/成骨细胞磷酸化糖原合成激酶3β(GSK-3β)磷酸化抑制线粒体通透性转换孔道(mPTP)开放的级联反应，可能在小鼠心肌缺血-复灌损伤中起关键作用[26]。

富集分析结果显示，丹参饮涉及的生物学过程复杂，发挥治疗作用可能相关的通路较多，主要包括心血管系统(如HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、钙信号通路)、炎症过程和免疫抑制(如TNF信号通路、T细胞受体信号传导途径、MAPK 信号通路)等。HIF-1信号通路，可以促进血管新生，上调与血管系统相关蛋白的基因表达，恢复组织血流，降低缺血性损伤[27]。PI3K-Akt信号通路在细胞存活与凋亡、心电生理和能量代谢等方面发挥着重要作用，是控制心肌细胞存活和功能重要的促增殖及抗凋亡信号通路之一[28]。钙信号通路与动脉钙化、心肌收缩功能、代谢调节等关系密切[29-31]。TNF信号通路可以调节免疫和炎症反应。MAPK信号通路在介导炎症、应激反应中起关键作用，可以干预动脉粥样硬化，调控血小板功能[32]。

综上所述，扩张型心肌病病因复杂，疾病对应靶点多样，客观分析疾病靶点作用的信号转导通路，达到针对性治疗的效果。丹参饮成分多样、靶点复杂、通路交错，关键节点大有牵一发而动全身的效果，把握关键点灵活调控网络作用机制。初步的分析表明，丹参饮可能通过抗炎、抗氧化、保护血管、调控心肌细胞等发挥治疗扩张型心肌病的作用，从一定程度上阐述了丹参饮的作用机制，也为后续的治疗提供了新的理论基础和探索方向。限于研究方法的局限性，中药成分、疾病及药物靶点有待完善，单药炮制、复方煎煮、人体吸收等一系列过程，组分间复杂的化学反应尚未明确，丹参饮治疗扩张型心肌病确切作用靶点及作用通路需进一步实验验证。