补肾活血汤治疗肾虚血瘀证慢性心力衰竭的代谢组学研究

胡心荷，韩 晶，周秉诚，李 洁，安佰海

慢性心力衰竭是指持续存在的心脏循环功能障碍所致的心力衰竭，被认为是所有心血管疾病的最终事件[1]。流行病学调查显示，我国慢性心力衰竭病人约有450万例，且以每年约50万例的速度增加[2]，严重威胁着国民的身体健康。现有的西药在治疗上具有诸多局限，如长期应用利尿剂会导致病人电解质紊乱；血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可能会导致低血压、高血钾、干咳等，非药物治疗由于技术、费用、适应证等的限制也未能给大多数慢性心力衰竭病人带来获益[3]。而中医强调整体观念、辨证论治，且副作用较小，近年来在临床上逐渐显露优势。

代谢组学是近年来兴起的一门学科，通过对生物体小分子代谢物，尤其是特征性潜在标志物进行全面系统的定量分析，得到真实的生物学事件表型数据，以寻找与疾病生理病理变化的相对关系[4]。可见其对人整体的代谢状况进行把握的观念与中医不谋而合，在提倡循证医学和个体化治疗的今天，代谢组学在中医学领域前景广泛[5]。针对慢性心力衰竭肾虚血瘀证病人研制的补肾活血汤，经过多年临床研究验证，取得了较满意的效果。本研究采用代谢组学的方法探求补肾活血汤治疗慢性心力衰竭肾虚血瘀证病人的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月—2019年6月就诊于青岛市海慈医疗集团心血管一科、心血管二科、干部保健科的慢性心力衰竭肾虚血瘀证病人共70例，随机分为试验组和对照组，各35例。另外选取2018年6月—2019年6月在青岛市海慈医疗集团体检中心的健康体检者35名为健康组，年龄30～80岁，身体健康，无近期感染史，无吸毒史、嗜酒史。

1.2 诊断标准 慢性心力衰竭符合Framingham的心力衰竭诊断标准[6]，中医肾虚血瘀证参照《中药新药临床研究指导原则》[7]，主症：气短、乏力、心悸、胸闷(痛)、腰膝酸痛；次症：头晕耳鸣、面浮肢肿、口干、小便短少、面色晦暗；舌脉：舌质暗红、苔少或薄白、脉细涩。具备主症和次症各2项及以上，结合舌脉即可诊断。

1.3 纳入标准 ①年龄18～80岁；②符合慢性心力衰竭的西医诊断标准且美国纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级为Ⅱ级或Ⅲ级，符合中医肾虚血瘀证证候诊断标准；③知情同意并签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①急性及亚急性心力衰竭、重度心力衰竭，或NYHA心功能分级为Ⅳ级；②合并严重感染性疾病或其他恶性原发病；③妊娠期及哺乳期妇女；④有严重精神疾病。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 维持西药常规治疗，根据《中国心力衰竭诊断和治疗指南》[6]的推荐，选用ACEI、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、利尿剂、洋地黄类、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂，试验期间不得合并使用其他中药汤剂和中成药制剂，疗程为2个月。

1.5.2 试验组 在西药常规治疗的基础上，加用中药方剂补肾活血汤，组方：制附子15 g(先煎)，补骨脂15 g，熟地黄21 g，山茱萸21 g，党参30 g，黄芪15 g，丹参21 g，赤芍15 g，葶苈子15 g(包煎)，大枣9 g。每日1剂，每次400 mL，分早、晚两次饭后半小时温服，持续2个月，试验药物由青岛市海慈医疗集团中药制剂室制备。

针对病人各自的基础疾病，参照相关治疗指南推荐，规范化进行控制血压、调脂、降糖、抗凝等西药治疗，不予其他中药制剂。并详细记录病人在观察期间所使用药物的名称、剂量、用药方法及用药时间；观察健康组试验期间有无突发新病及特殊状况。

1.6 血清样本采集 所有参与试验人员在采血前要求空腹8 h，1周内未饮咖啡、浓茶等，无其他有关饮食、生活方式、生理周期等的严格限制。于06：00左右在室温下釆取4 mL静脉血液样本，自然凝固1 h后收集血清，于4 ℃下3 000 g离心10 min，收集上清液，置于-80 ℃冰箱冷冻待测。

1.7 核磁共振波谱试验(NMR) 充分混匀血清样品后，取200 μL与重水配制的磷酸盐缓冲液400 μL充分混匀，在4 ℃下以12 000 r/min速率离心10 min，取560 μL加入核磁管，在Agilent-600高分辨核磁共振谱仪上进行NMR检测，1H频率为600.11 MHz，配备三共振高分辨探头。采样温度为298 K，采样次数为64次。每个样品采样前控温至少5 min，每个样品的90°脉冲宽度调整为10 μs左右，等待时间为2 s，每个样品进行预饱和压水峰的CPMG(carr-purcell-meiboom-gill)试验，总的自旋-自旋回波时间为200 ms，在弛豫延迟期间进行预饱和压水。

1.8 数据预处理与分析 对采集的所有一维1H-NMR谱图的自由感应衰减信号(FID)加上增宽因子为1 Hz的指数窗函数后进行傅立叶变换以提高信噪比，手动进行相位和基线校正，所有样品的核磁共振谱图采用TSP进行定标。利用相关软件将核磁共振谱图进行积分，将积分后的数据归一化后进行多变量数据统计分析，建立数学模型，得到用于评价模型质量的指标：R2X、R2Y和Q2。将潜在生物标志物导入Metaboanalyst数据库，研究与心力衰竭相关的代谢通路。

2 结 果

2.1 1H-NMR谱图 选择各组中具有代表性的核磁共振谱图，根据一维谱图并结合公共数据库(HMDB)对采集到的核磁共振信号进行归属，从3组获得血清代表性CPMG 1H-NMR光谱(δ 0.7～5.4和δ 5.4～9.0)。为了清楚起见，与相应的δ 0.7～5.4区域相比，δ 5.4～9.0的区域(虚线框中)被放大了16倍。详见图1。

图1 3组血清1H-NMR谱图及主要代谢物谱峰归属(δ 0.7～5.4和δ 5.4～9.0)

2.2 主成分分析(PCA) 用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，PCA分析使用中心化换算，得到的数据分布越集中，表示组间差异越小；离散度越大，表示组间差异就越大。①总体PCA分析结果显示，R2X=74.8%，Q2=0.728，详见图2；②健康组与试验组的PCA分析结果显示，R2X=73.3%，Q2=0.677，详见图3；③健康组与对照组的PCA分析结果显示，R2X=87.2%，Q2=0.861，详见图4；④试验组与对照组的PCA分析结果显示，R2X=83.5%，Q2=0.804，详见图5。

图2 总体样本的PCA得分图

图3 健康组与试验组的PCA得分图

图4 健康组与对照组的PCA得分图

图5 试验组与对照组的PCA得分图

2.3 偏最小二乘法-判别分析及验证(PLS-DA) 使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行PLS-DA分析，寻找数据之间的相关性；通过多次改变分类变量y的排列顺序对模型有效性做进一步检验。①健康组和试验组的PLS-DA分析及验证结果显示，R2X=31.9%，R2Y=0.732，Q2=0.541，截距：R2=(0.000，0.742)，Q2=(-0.201，0.000)，详见图6；②健康组与对照组的PLS-DA分析及验证结果显示，R2X=31.7%，R2Y=0.705，Q2=0.344，截距：R2=(0.000，0.763)，Q2=(-0.142，0.000)，详见图7；③试验组与对照组的PLS-DA分析及验证结果显示，R2X=28.1%，R2Y=0.705，Q2=0.431，截距：R2=(0.000，0.719)，Q2=(-0.208，0.000)，详见图8。

图6 健康组与试验组的PLS-DA得分图、排列试验图(A为PLS-DA得分图；B为排列试验图)

图7 健康组与对照组的PLS-DA得分图、排列试验图(A为PLS-DA得分图；B为排列试验图)

图8 试验组与对照组的PLS-DA得分图、排列试验图(A为PLS-DA得分图；B为排列试验图)

2.4 正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA) 使用SIMCA-P+软件对正交信号矫正处理过的PLS-DA模型进行OPLS-DA分析，寻找对分组贡献性较大的谱峰信号和相应代谢物。①健康组与试验组的OPLS-DA分析结果显示，R2X=31.9%，Q2=0.455，详见图9；②健康组与对照组的OPLS-DA分析结果显示，R2X=31.8%，Q2=0.313，详见图10；③试验组与对照组的OPLS-DA分析结果显示，R2X=21.8%，Q2=0.431，详见图11。

图9 健康组与试验组的OPLS-DA得分图及相应系数载荷图(A为OPLS-DA得分图；B、C为相应系数载荷图)

图10 健康组与对照组的OPLS-DA得分图及相应系数载荷图(A为OPLS-DA得分图；B、C为相应系数载荷图)

图11 试验组与对照组的OPLS-DA得分图及相应系数载荷图(A为OPLS-DA得分图；B、C为相应系数载荷图)

2.5 差异代谢物的筛选及鉴定 将每一个变量的loading值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换，然后与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起组间差异的代谢物。相关系数的正负号分别表示浓度的正负相关，在P=0.05且df(自由度)=29时判别显著性，将∣r∣>0.355的相关系数作为有统计学意义的临界值，小于此系数则忽略不计。详见表1。

表1 3组间对分组贡献较大的差异代谢物浓度变化

2.6 差异代谢物的相关通路分析 将获得的19种潜在生物标志物导入Metaboanalyst数据库，研究与心力衰竭相关的代谢通路，如图12所示，代谢通路影响值(pathway impact)由拓扑分析计算所得，代谢通路影响值和-logP分别代表代谢通路的重要性和代谢通路富集分析的显著性水平[8]。本研究中选择代谢通路影响值的临界设置为0.1，高于此值认为与潜在的靶标路径关系密切。共筛选出4条与补肾活血汤治疗慢性心力衰竭肾虚血瘀证相关的代谢通路：苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢。

图12 差异代谢物参与的代谢途径富集分析

3 讨 论

代谢组学是系统生物学的重要组成部分，能够灵敏地揭示生物体内源性物质受刺激后引起的代谢物的变化，近年来广泛应用于中医证候机制研究。中药方剂作用在机体不同层次的不同靶标上会引起一系列内源性代谢物的组成和浓度发生变化，通过测定这些相互关联的变化有利于从全局上把握中药方剂的作用机制。

李洁教授在长期的诊疗实践过程中发现，慢性心力衰竭病人的多个证型中，以肾虚血瘀证最为常见。认为其基本病机为肾虚血瘀、瘀血阻脉、气血不畅、水道不通，治疗上以补肾活血、化瘀利水为法。基于这一理论创立补肾活血汤，临床应用多年，取得了满意的疗效。

从1H-NMR谱图中可以看出，3组代谢物多为氨基酸、糖类、脂类等小分子物质。总的PCA得分图显示，3组样本之间的聚集现象明显，说明有统计学意义，健康组样本点分布相对集中，表明个体之间差异较小；试验组和对照组样本点分布相对分散，表明两组自身个体之间差异较大。之后分别在3组之间进行两两PCA分析比较，发现组间都有明显的聚集现象，提示有统计学意义，且组间的样本点分布较为分散，说明代谢物差异显著，其中健康组和试验组重合的样本点相对较多，说明两组相似度更大。

通过PLS-DA得分图和排列试验验证结果，与模型的可解释指标R2X和可预测指标Q2共同提示，所建立的数学模型稳定可靠，说明组间代谢物差异较为显著。后对进行过PLS-DA分析的数据进一步进行OPLS-DA，获得19个对分组贡献性较大的谱峰信号和相应代谢物，主要包括氨基酸、脂类和糖类，与健康组相比，对照组中有13个差异代谢物发生显著变化，经补肾活血汤给药后，其中9个具有回调作用，主要包括苯丙氨酸、酪氨酸、柠檬酸等，依据这9个回调的生物标志物找到苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢等4条相关代谢通路。

苯丙氨酸是人体必需的氨基酸，由膳食中的蛋白质提供，通过掺入细胞蛋白、转化为苯丙酮酸、转化为酪氨酸进入人体，酪氨酸可转化为左旋多巴，然后进一步转化为多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素[9]，去甲肾上腺素和肾上腺素均可收缩血管，增强心肌收缩力。在该条通路中描述的是苯丙氨酸通过氨基酸氧化酶或酪氨酸氨基转移酶转化为苯丙酮酸、苯丙氨酸通过苯丙氨酸羟化酶转化为酪氨酸以及苯丙氨酸和/或酪氨酸并入多肽，这个反应既作为苯丙氨酸和酪氨酸分解代谢的第一步，又作为酪氨酸的来源[10]。考虑可能由于慢性心力衰竭病人酶缺陷或氨基酸吸收转运系统缺陷，氨基酸的代谢通路受阻，导致对照组苯丙氨酸、酪氨酸的含量较健康组明显减少，给药后扭转了趋势，说明补肾活血汤发挥了正向的干预调节作用。

在成年哺乳动物中，精氨酸主要通过肠-肾轴进行合成[11]，在包括尿素循环、多聚氨基酸和肌酸合成、免疫功能调节和一氧化氮合成在内的正常和疾病状态下的各种代谢过程中起关键作用[12]。精氨酸作为免疫调节剂，对机体炎症的抑制至关重要，研究表明，精氨酸不仅可以通过一氧化氮代谢途径增强机体免疫能力，而且能调节蛋白激酶信号通路抑制促炎基因表达[13-14]。该条通路显示补肾活血汤可能通过炎症抑制、免疫功能等方面参与调节。

淀粉和蔗糖代谢途径中，唾液中的淀粉酶在淀粉消化中起重要作用，淀粉消化的产物包括但不限于麦芽三糖、麦芽糖、极限糊精和葡萄糖，小肠微绒毛的肠上皮细胞进一步将极限糊精和二糖分解为葡萄糖、半乳糖和果糖[15]。葡萄糖是维持细胞活动的最基本的能量来源，通过三羧酸循环的方式参与供能，三羧酸循环是糖脂代谢的最终通路，是机体获得能量的主要方式，三羧酸循环受阻意味着葡萄糖、脂肪的代谢紊乱[16]。柠檬酸是三羧酸循环中的重要中间产物，由乙酰辅酶A和草酰乙酸缩合而成，除了参与三羧酸循环供能外，柠檬酸还涉及体内的有氧代谢，其形成减少表明有氧代谢的减弱[17]。临床上心力衰竭常合并低氧血症，低氧血症的发生可进一步加重心力衰竭[18]。相比于对照组，给药后试验组葡萄糖和柠檬酸含量明显增加，说明补肾活血汤可以调节代谢途径，降低三羧酸循环、有氧代谢受到抑制的程度。

综上所述，本研究对慢性心力衰竭肾虚血瘀证病人的代谢标志物进行了初步的探索，获得了一些潜在的标志物，并探索了4条主要的代谢通路，为进一步探索中医药防治慢性心力衰竭肾虚血瘀证提供了客观的生物学支持。试验的设计与实施较为科学合理，验证了补肾活血汤能有效改善慢性心力衰竭肾虚血瘀证病人部分紊乱的代谢物水平，主要涉及苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢等。