槲皮素对心肌缺血再灌注大鼠氧化应激反应及心电图的影响

宣学习，张 宇，张 华，张传西，袁义强

缺血性心脏病是由冠状动脉循环改变引起冠状动脉血流和心肌能量代谢失衡导致的心肌损伤疾病，在心脑血管疾病中极为常见，且在老年人中发病率较高，以心绞痛、休克、心律失常及心力衰竭为主要临床表现[1-2]。随着人们生活水平的提高，冠状动脉粥样硬化呈年轻化趋势，年龄较小人群中出现心肌缺血疾病愈发常见，临床手术中及时发现并且对缺血的冠状动脉实行血液再灌注可使组织器官功能恢复，有效降低死亡率。然而，一些情况下，冠状动脉部分或完全急性阻塞后在一定时间内恢复血液流动，不仅不能恢复组织器官功能，反而使组织病理损伤加重，发生不可逆的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[3]。槲皮素(Quercetin，QU)是广泛存在的黄酮类药物，具有降低血压、减少毛细血管脆性、扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量、对抗自由基等功效[4-5]。研究表明，槲皮素可以通过缓解炎症反应，减少细胞凋亡，减轻肾脏缺血再灌注损伤[6-7]。但槲皮素对MIRI发生时氧化应激作用研究较少。本研究通过对氧化应激指标及心脏电活动的比较，探讨槲皮素在MIRI发生时对心肌的保护作用，为缺血性心脏疾病的治疗及预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量(250±50)g，购自广州相观生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0043，适应性饲喂7 d。

1.1.2 实验试剂及仪器 凋亡细胞原位末端转移酶标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA检测试剂盒、酶标仪均购自Thermo Fisher Scientific公司，兔抗大鼠单磷酸腺苷活化蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)抗体一抗、兔抗大鼠p-AMPK抗体一抗、兔抗大鼠结节性脑硬化复合物2(tuberous sclerosis complex-2，TSC2)抗体一抗、兔抗大鼠p-TSC2抗体一抗、兔抗大鼠雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗体一抗、兔抗大鼠p-mTOR抗体一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自美国CST公司，UV-1200紫外分光光度计(上海美析仪器有限公司)，ECG-1350P型十二导联心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司)，光学显微镜(上海万衡精密仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模及分组 将48只大鼠按随机数字表法分为模型组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组、阳性药物组4组，每组12只，采用冠状动脉结扎法建立MIRI模型[8]。建模前12 h禁食，用2%戊巴比妥对各大鼠进行麻醉，15 min后将其移至解剖台上并呈仰卧位，分别捆绑上下肢并连接心电图机，观察心电变化。将各大鼠颈部、胸前备皮、消毒后，分离颈部气管并插入气管插管，调整呼吸机参数进行连接(呼吸频率100次/min)。于第三胁或第四肋间顺肋间隙的方向偏胸骨左缘的位置开胸，暴露心脏并打开心包，将5-0缝合线沿左心耳下方2 cm冠状动脉前降支穿过，将一小段直径1.5 cm的乳胶管垫于缝合线上，收紧缝合线、结扎冠状动脉造成心肌缺血。缝合线下心肌颜色变暗，左心室缺血变白，心电图ST段弓背向上抬高，说明心肌缺血成功，此过程持续30 min；剪断缝合线，恢复灌注后，可见缝合线下左心室颜色由白逐渐变红，心电图ST回落，说明再灌注成功，此过程持续120 min，排除结扎前心电图异常及未到观察终点即死亡大鼠。剩余12只大鼠为假手术组，仅打开胸腔，不结扎冠状动脉。建模结束后，假手术组大鼠剩余10只，模型组6只，槲皮素低剂量组7只，槲皮素高剂量组9只，阳性药物组10只。

1.2.2 干预 槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组、阳性药物组分别用25 mg/kg 槲皮素、50 mg/kg 槲皮素、3 mg/kg依达拉奉经尾静脉注射给药，假手术组及模型组用等量生理盐水尾静脉注射给药，每天1次，持续4周。

1.2.3 观察各组大鼠心电图 将大鼠四肢连接心电图机，观察30 min内心电图变化情况。

1.2.4 计算各组心肌梗死面积 再灌注结束后，各组分别取3只大鼠心脏，用生理盐水洗去血污，将心脏切成0.1～0.3 cm厚心肌片，将2片新鲜心肌横断面进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色，于37 ℃温孵15 min，其余心肌片于-80 ℃冻存。正常心肌组织变蓝色而梗死心肌不着色，用Image Pro-Plus Version 4.5图像分析软件计算心肌横断面梗死面积及整个左心室心肌横断面面积，心肌梗死面积用横断面梗死部分占左心室心肌横断面积的百分比表示。

1.2.5 苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织病理变化 将剩余心肌片用生理盐水漂洗、滤纸吸干后置于4%甲醛溶液中固定，经酒精脱水、石蜡包埋后切片，进行HE染色，于光学显微镜下观察心肌组织病理变化。

（1）分别根据所设置的modelA：Logistic(A_P)=-2+6*X1+0.5*X2，A_P=exp(logit(A_P))/(1+exp(logit(A_P)))和modelB：Logistic(B_P)=-4+10*X1+2.5*X2，B_P=exp(logit(B_P))/(1+exp(logit(B_P)))产生样本量足够（例如50 000例）数据集，每个患者有三个变量值，即Xi 1,Xi 2,Pi。

1.2.6 TUNEL法观察细胞凋亡情况 取心肌切片，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，常规处理左心室石蜡标本，凋亡心肌细胞胞核为荧光绿色，正常心肌细胞则为蓝色。于200倍视野下统计凋亡细胞数和总细胞数，细胞凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.7 检测ROS、MDA、SOD含量 处死各组剩余大鼠，取心肌组织100 mg，放入离心管中，制成10%的匀浆液，后置于高温沸水浴箱内10min，取出后摇匀，3 500 r/min(半径8 cm)离心10 min后，取上清检测。严格按照各说明书进行操作，ELISA检测试剂盒分别检测ROS、MDA、SOD含量，取波长450 nm，酶标仪读数，测定各孔吸光度值，根据标准曲线，分别计算ROS、MDA、SOD含量。

1.2.8 检测AMPK、p-AMPK、TSC2 、p-TSC2 、mTOR、p-mTOR的表达情况 另取各组剩余大鼠心肌组织100 mg，提取总蛋白并进行蛋白定量，每孔道加入50 μg蛋白进行SDS-PACE电泳后转膜，于5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h。后加入ECL试剂，进行数据分析，以目的蛋白条带灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠心电图变化比较 除假手术组外，其余各组造模过程中，缝合线收紧冠状动脉前降支后，左心室呈灰白状，心电图显示ST段弓背向上抬高，30 min后剪断缝合线恢复前降支血流，表明造模成功。假手术组心电图正常，模型组心电图有明显的心律失常现象出现，槲皮素高剂量组、槲皮素低剂量组心律失常现象均有明显改善，但略低于阳性药物组，阳性药物组心电图表现较好。详见图1。

图1 各组大鼠心电图变化情况

2.2 各组大鼠心肌梗死面积比较 大鼠心肌梗死面积组间比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。与模型组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组及阳性药物组心肌梗死面积均缩小，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素低剂量组比较，槲皮素高剂量组及阳性药物组心肌梗死面积缩小，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素高剂量组比较，阳性药物组心肌梗死面积缩小，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较(±s) 单位：%

图2 HE染色下各组大鼠心肌组织病理变化(×200)

2.4 各组心肌细胞凋亡率比较 各组大鼠心肌细胞凋亡率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组及阳性药物组心肌细胞凋亡率均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素低剂量组比较，槲皮素高剂量组及阳性药物组心肌细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素高剂量组比较，阳性药物组心肌细胞凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图3。

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较(±s) 单位：%

图3 TUNEL检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况(×200)

2.5 各组ROS、MDA、SOD含量比较 各组大鼠心肌组织ROS、MDA、SOD含量组间比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。与假手术组比较，模型组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组及阳性药物组心肌组织ROS、MDA含量均升高， SOD含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组及阳性药物组心肌组织ROS、MDA含量均降低，SOD含量均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素低剂量组比较，槲皮素高剂量组及阳性药物组ROS、MDA含量均降低，SOD含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素高剂量组比较，阳性药物组心肌组织ROS、MDA含量均降低，SOD含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌组织ROS、MDA、SOD含量比较(±s)

2.6 各组AMPK、p-AMPK、TSC2、p-TSC2、mTOR、p-mTOR的相对表达量比较 大鼠心肌组织p-AMPK、p-TSC2、p-mTOR相对表达量组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，模型组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组及阳性药物组p-AMPK、p-TSC2相对表达量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，p-mTOR相对表达量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组及阳性药物组p-AMPK、p-TSC2相对表达量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，p-mTOR相对表达量均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素低剂量组比较，槲皮素高剂量组及阳性药物组p-AMPK、p-TSC2相对表达量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，p-mTOR相对表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与槲皮素高剂量组比较，阳性药物组p-AMPK、p-TSC2相对表达量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，p-mTOR相对表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；AMPK、TSC2、mTOR表达情况组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4、图4。

表4 各组大鼠心肌组织AMPK、p-AMPK、TSC2、p-TSC2、mTOR、p-mTOR的表达情况比较 (±s)

图4 Western Blot检测各组大鼠心肌AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR表达情况

3 讨 论

MIRI是由于冠状动脉及其分支的粥样硬化导致冠状动脉狭窄甚至闭塞，引起心肌超微结构、能量代谢、细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等一系列损伤变化，这些损伤在血管恢复灌注后更加突出，严重者出现心律失常甚至猝死[9]。一般认为MIRI发生与再灌注时氧自由基大量生成有关[10]。雷晓鸣等[11]研究表明，槲皮素能够减轻血脑屏障损伤，减少ROS生成，改善大鼠脑缺血再灌注损伤。本研究通过比较不同剂量槲皮素对MIRI后氧化应激相关因子及AMPK/TSC2/mTOR通路相关指标的作用，明确其在MIRI发生后对心肌的保护作用及机制。

线粒体是细胞能量物质生成储存场所，可以进行正常物质调控，使体内自由基产生及清除处于动态平衡，而不对机体造成影响。当心肌缺血缺氧时线粒体无法进行正常有氧氧化及能量代谢，能量产生减少，血液重新灌注时，脂质过氧化反应增强，自身抗氧化能力减弱，氧气在蛋白激酶C等催化下生成活性氧类物质及过氧化氢等，与此同时产生过量ROS、MDA，由于自由基的清除依赖SOD等抗氧化酶系统，过量ROS、MDA在消耗抗氧化酶的同时，仍有大量存在[12-13]。尹方等[14]研究表明，银杏叶提取物含黄酮类物质，可以有效捕获自由基，改善微循环，抑制大鼠脑缺血再灌注损伤发生。另有研究表明，MIRI的发生常伴随细胞凋亡，而丙泊酚联合槲皮素可以提高氧化应激条件下心肌细胞抗氧化能力，减少氧化应激条件下心肌细胞凋亡[15-16]。本研究结果中，模型组心电图出现明显心律失常，槲皮素低、高剂量组心律失常现象有所改善，且槲皮素高剂量组效果更好；HE染色显示，模型组心肌纤维排列紊乱，核裂解消失，而槲皮素低、高剂量组病理变化较轻；此外，槲皮素各剂量组心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率及ROS、MDA含量较模型组均降低，而SOD含量升高，提示槲皮素可以清除自由基，降低过氧化反应，改善心电图及心肌组织病理变化，与既往研究结果一致。

AMPK是细胞内重要的代谢传感器，主要参与维持代谢应激下能量平衡和氧化还原稳态，与心脏能量代谢密切相关[17]。在缺血缺氧或氧化应激加强的情况下，AMPK被大量激活，磷酸化水平升高，从而引起TSC2激活，进而使mTOR活性降低[18]。由于mTOR是蛋白合成的重要通路，当其活性降低时，肌细胞相关蛋白合成受到抑制[19-20]。槲皮素可以通过抑制AMPK/TSC2/mTOR信号通路，缓解中脑动脉闭塞大鼠脑组织的异常自噬[21]。唐丹丽等[22]研究表明，痰瘀同治方可通过抑制因缺氧复氧而激活的心肌细胞AMPK/mTOR通路，对心肌发挥保护作用。本研究结果中，与模型组比较，槲皮素各剂量组p-AMPK、p-TSC2表达量降低，p-mTOR表达量升高，且槲皮素高剂量组效果更好，提示槲皮素可以通过抑制AMPK/TSC2/mTOR相关通路，降低MIRI心肌组织损伤，与既往研究结果相符。

综上所述，槲皮素对MIRI后氧化应激反应具有一定抑制作用，可改善心电图，减少心肌凋亡心肌损伤，其机制可能与抑制AMPK/TSC2/mTOR通路有关。