基于网络药理学和分子对接技术探讨桑寄生-杜仲药对治疗原发性高血压的作用机制

吴佳芸，李玲玲，孙 瑞，杨德爽，乔佳君，姚睿祺，朱春临，黄 力

原发性高血压(essential hypertension，EH)是临床最常见的心血管病，是一种受遗传、环境等多因素影响的以体循环动脉压力升高为特点，目前病因与机制尚未完全明确的疾病。原发性高血压在高血压人群中约占95%，是诸多疾病的高危因素，更能诱发冠心病、心肌梗死、糖尿病、脑卒中等高度致残和致死性疾病的发生。有统计显示，全球近1/5的人口罹患高血压，每年因高血压并发症死亡的人数多达940万人[1]；而我国的高血压现患人数高达2.9亿人，且发病趋于年轻化[2]。我国高血压调查发现，34岁以下男性发病率高达20.4%[3]，少年儿童高血压发病率年均增加0.16%[4]。由此可见，高血压的防治工作刻不容缓。当前指南提出的早期、规范、联合应用西药降压治疗虽有一定效果，但其副作用明显，且逐步出现药物耐受。中医学将高血压归于“眩晕”“头痛”范畴，认为肝阳上亢、痰浊内阻以及肝肾亏虚是其重要病机，强调从整体上抓病机，辨证论治，以恢复病人自身阴阳平衡，很少有不良反应，因而具有很大优势。而桑寄生、杜仲便是其中重于调补肝肾、用于治疗肝肾亏虚型高血压的代表要药[5]。

桑寄生味苦、甘、平，入肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、除风湿、通经络、安胎之效；杜仲味辛、平，亦入肝肾二经，颇具补益肝肾、强筋壮骨、安胎之功。二者均最早载于《神农本草经》，均可主治腰脊疼痛、可坚筋骨齿发，故后世常将二者作为药对使用。现代药理研究证明，桑寄生具有降脂、降糖、降压、抗炎镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、利尿、增强记忆、保护神经等作用[6]，广泛用于高血压、心律失常、高脂血症、缺血性中风、骨关节病、强直性脊柱炎、慢性乙型病毒性肝炎、腰椎间盘突出、蛋白尿、尿毒症、先兆流产、习惯性流产以及冻伤等治疗[7]；而杜仲则具有降压、降糖、调节血脂、抗炎、预防骨质疏松、护肝、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、抗疲劳、镇静催眠、抑菌等作用[8]，临床多用于治疗高血压、骨质疏松症、膝骨性关节炎、腰肌劳损、腰椎间盘突出症、肾虚腰痛、胎动不安、先兆流产、阳痿等[9]。研究发现，应用桑仲汤治疗70例原发性高血压病人，3个月后总有效率高达90%，病人舒张压和收缩压均有明显改善，且失眠、头痛、心烦等整体症状好转[10]。仝小林教授常用怀牛膝、炒杜仲(6～10 g)、桑寄生(9～15 g)三味小方治疗老年或久病体虚，脉管弹性变差，脉压较大，属于“病脉络”至“病脏腑”阶段的“肾虚态”高血压，效果甚好[11]。然而，这其中的作用机制以及桑寄生-杜仲药对的主要活性降压成分目前尚还不清楚。网络药理学是挖掘中药有效成分与疾病靶点、观察药物对疾病的作用网络、预测药物作用靶标继而揭示药物协同作用于人体机制的系统生物学方法，对于解释中药的复杂作用网络具有重要意义。因而，本研究应用网络药理学和分子对接技术，从桑寄生-杜仲药对降压入手，探索其治疗原发性高血压的初步机制。

1 资料与方法

1.1 筛选桑寄生、杜仲中有效活性成分及靶点 在中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中搜索桑寄生、杜仲2味中药的有效活性成分和作用靶点(http: //lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)。根据口服用药在体内代谢经过吸收、分布、代谢、排泄(ADME)等过程后最终发挥生物学作用的特点，将口服生物利用度(oral bioavailability，OB)设置为≥30%，类药性(drug likeness，DL)设置为≥0.18进行筛选。此外，结合TCMID、YaTCM数据库中有关桑寄生、杜仲的活性化合物信息，以及PubMed、中国知网、维普、万方数据库中的相关文献，补充TCMSP数据库中可能遗漏的靶点。利用UniProt KB(https://www.uniprot.org)数据库规范蛋白质所得靶点的名称和信息，得到便于识别的基因名称。

1.2 获取原发性高血压疾病靶点库 基于GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(http://www.omim.org)与DisgeNET数据库(https://www.disgenet.org)，以“hypertension”“high blood pressure”“essential hypertension”为关键词查找原发性高血压相关的疾病靶点，同时结合DrugBank数据库中依据临床用药发现的有关靶点，参考Score值(值越高则疾病靶点间的联系越紧密)进行靶标筛选并删除重复的靶点，最终得到原发性高血压的疾病靶点库。

1.3 构建桑寄生-杜仲药对的“药物-成分-作用靶点”网络 通过Cytoscape 3.8.0软件构建桑寄生-杜仲药对的“药物-成分-作用靶点”网络，其中有效成分、靶点、疾病以节点图标表示，而相互间的作用关系以连线表示。节点的大小反映了活性成分和靶点与原发性高血压的相关性和重要度，节点越大，相关性和重要性越高。

1.4 构建活性成分与原发性高血压共同靶点的蛋白相互作用(PPI)网络 取桑寄生、杜仲的有效成分和原发性高血压相关的疾病靶点的交集，通过在线绘图工具绘制韦恩图(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)。随后将疾病与药物共同靶点输入String Version 11 (https: //string-db.org/)，物种设置为“人”，得到PPI网络，导出TSV文件。此外，通过MCODE插件对PPI网络进一步分析，得到潜在的重要蛋白质功能模块，试图分析并阐释其参与的生物学进程。

1.5 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析核心靶点基因功能 通过DAVID数据库获取关键靶点的GO注释和KEGG富集的相关信息，并利用在线绘图工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行基因功能分析的可视化展示。

1.6 构建桑寄生-杜仲药对的“成分-靶点-信号通路”网络 利用Cytoscape 3.8.0构建桑寄生-杜仲药对的“成分-靶点-信号通路”网络，并根据连接度、中介中心性等网络拓扑学参数判断主要发挥作用的靶点、核心成分以及参与调节的重要信号传导途径。

1.7 分子对接验证 通过Swiss Dock (http://www.swissdock.ch/)平台分析桑寄生-杜仲药对成分与原发性高血压网络图中度值排名前2位的靶点与桑寄生-杜仲药对中的排名前5位的主要活性成分进行对接，事先确定靶点对应蛋白的PDB ID和获取活性成分的mol2格式文件，参考估算热结合能ΔG的值判断结合活性和对接效果。

2 结 果

2.1 桑寄生与杜仲的有效活性成分及靶点 最初共获得桑寄生化学成分78种、杜仲化学成分120种，经ADME筛选后共获得桑寄生2种、杜仲21种活性成分，包括槲皮素、谷甾醇、山奈酚、麦甾醇、赤藓碱、表儿茶素、丁香脂素等，其中槲皮素为二者共同成分，详见表1。桑寄生成分作用靶点13个，杜仲成分作用靶点128个，合并后剔除重复值共得到靶点128个。

2.2 原发性高血压相关靶点 在GeneCards数据库中得到原发性高血压相关靶点共计8 435个，参考以往文献及经验以Score大于或等于中位数为条件连续3次进行原发性高血压疾病重要靶点的筛选，如通过GeneCards所得靶点Score值最小为0.09、最大为130.77，3次设立的中位数分别为1.47、3.19和6.06，最终以Score≥6.06的靶点作为潜在靶点。同时参照OMIM、DisgNET、DrugBank数据库补充靶点，进行数据合并，去除重复靶点后得到1 398个原发性高血压相关靶点。

2.3 桑寄生-杜仲药对的“药物-成分-作用靶点”网络 将所得桑寄生-杜仲药对中关键成分和靶点录入Excel中进行整理，建立Network文件和属性文件分别导入Cytoscape 3.8.0，得到153个节点、409条连线。按照node type分别筛选出桑寄生、杜仲以及基因，设置大小、形状、排列方式等参数，同时进行网络分析计算Degree值并以节点的大小等比例进行呈现(见图1)。由图1可知，山奈酚、β-谷甾醇、表奎尼丁、烟碱大黄素、槲皮素、赤藓碱、β-胡萝卜素、丁香脂素、3-羟基亚甲基丹参醌等是桑寄生与杜仲药对中的核心化合物，而PTGS2、PIK3CG、AKT1、PTGS1、HSP90、KCNH2、NCOA2、CASP3、CASP9、SCN5A、CALM、PRKACA、RELA等是主要的作用靶点。

图1 桑寄生-杜仲药对的“药物-成分-作用靶点”网络图

2.4 桑寄生与杜仲中有效成分与原发性高血压疾病靶点的PPI网络 找出桑寄生-杜仲与原发性高血压病的交集，绘制韦恩图，获得二者共同靶点124个，将所得交集靶点输入String Version 11，设置highest confidence(0.900)，构建药物活性成分与靶点的PPI网络，得到121个节点、339条连线，详见图2。进一步应用Cytoscape 3.8.0的MCODE插件对PPI网络中连线密度较高的子网络Module进行提取分析，找出主要的多蛋白复合体功能体和同通路中的重要功能模块，详见图3。根据P值选择3个最佳评分的生物学过程进行描述，分别是血液循环、G蛋白偶联受体信号传导途径和细胞对有机环化合物的反应过程，详见表2。

图2 交集靶点PPI网络图

图3 PPI网络中的关键模块

表2 交集靶点PPI Top3 Module功能描述

2.5 核心靶点的生物功能与信号通路富集分析 从David数据库获取关键靶点的GO和KEGG信息，通过在线平台分别按照富集倍数和P值筛选分析对象进行结果的可视化呈现，结果显示，桑寄生-杜仲药对主要参与的生物学过程包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的双向调控、正向调控转录、细胞增殖、ERK1和ERK2级联反应、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路、蛋白激酶B信号转导的正调控、细胞间信号、化学突触传递、血管生成、凋亡过程的负调控等，主要集中于发挥与锌离子结合、转录因子活性调节、序列特异性DNA结合、血红素结合、蛋白质二聚体活性、染色质结合、药物结合、铁离子结合等的相关分子功能。而相关靶点所参与的通路主要富集于神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、环磷酸鸟苷(cGMP)-环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶(PKG)信号通路、细胞凋亡、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路等。详见图4、图5。

图4 桑寄生-杜仲主要成分靶点的GO分析(BP为生物过程，CC为细胞组成，MF为分子功能)

图5 桑寄生-杜仲主要成分靶点的KEGG通路富集分析

2.6 桑寄生与杜仲中有效成分-靶点-通路网络图 将所得桑寄生-杜仲主要活性成分和原发性高血压共同靶点和富集通路联系起来，利用Cytospace 3.8.0构建“桑寄生与杜仲中有效成分-靶点-通路网络图”，详见图6。通过内置的网络分析功能获取桑寄生-杜仲治疗原发性高血压的网络拓扑学参数数据，进而比较找出最为关键的有效成分和作用点，详见表3。

表3 桑寄生-杜仲主要有效成分及作用靶点的网络节点特征参数

图6 桑寄生-杜仲药对有效成分-靶点-通路网络图

2.7 分子对接验证 选取连接度排名前2位的靶点(分别是PTGS2与CALM)，以及排名前5位的活性成分，依次为山奈酚、烟碱大黄素、表奎尼丁、β-谷甾醇、槲皮素。通过Swiss Dock进行对接模拟和分析分子通路图配体-受体结合动作，验证关键靶点与成分之间的结合潜能和活性，其中Full Fitness和能量值越低结合效果越好，详见图7。结果显示，各靶点与主要活性成分估算ΔG均<-29.30 kJ/mol，Full Fitness均<-5 023.20 kJ/mol。PTGS2与Top5成分的对接Full Fitness更是低于-8 372.00 kJ/mol，提示较好的结合活性。同时，结合能越低，分子对接的效果越好。详见表4。

图7 Top2靶点与Top5成分的对接模式图

表4 Top2靶点与活性成分对接的详细信息

3 讨 论

原发性高血压是发病率最高的心血管疾病，其导致的靶器官损害也已成为病人死亡主因。中医药调治血压异常依据整体辨证个性化施治具有显著特色和优势，尤其在避免类似西药降压存在的不良反应和改善病人整体症状方面。肝肾亏虚型高血压是临床中常见的类型，采用补益肝肾法治疗原发性高血压更是收效甚丰。刘丽娟等[12]研究显示，复方桑寄生钩藤颗粒高、中剂量不仅能降低高血脂大鼠血脂水平，更能明显降低收缩压和舒张压，效果优于利血平阳性药物。对复方杜仲片的临床观察结果也显示其能有效降低病人血压，改善高血压病人头晕头痛、腰膝酸软、耳鸣、五心烦热等症状。

而在补肝肾治疗高血压的用药规律中发现，治疗老年性肾气亏虚型高血压使用频次位列前5位的中药中，桑寄生位列第2位[13]。张莉等[14]观察了6种不同寄主桑寄生药材对原发性高血压大鼠血压的影响，发现除了夹竹桃寄主桑寄生外，各寄主来源桑寄生均具有降压作用，并且高剂量桑树和柳树寄主桑寄生可减少自发性高血压大鼠(SHR)血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和内皮素-1(ET-1)水平(P<0.01)；而桑树、柳树、枫香树寄主高剂量桑寄生还可明显改善SHR血清一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.01)。而对360首治疗高血压的804味中药进行频次分析发现，杜仲使用频次高达108次，排名第2位[15]。杜仲中的木质素类、阿魏酸、槲皮素等10多种成分均有降压作用[16]；且桑寄生与杜仲的关联规则置信度为0.584，说明二者常配合应用[15]。郭维琴教授常用桑寄生、杜仲配伍治疗肝肾阴虚型高血压，对伴有腰膝酸软、筋骨无力者，疗效明显[17]，而含桑寄生、炒杜仲为主的“寄屑思仙花生醯”方治疗高血压的疗效也较明显[18]。

鉴于以上基础，本研究从桑寄生-杜仲药对入手探索其治疗原发性高血压的潜在机制，结果发现：桑寄生与杜仲的主要活性成分有槲皮素、山奈酚、烟碱大黄素、β-谷甾醇、丁香脂素等，其中槲皮素为二者共同成分。多项研究证实，槲皮素不仅可降低SHR、Dahl盐敏感性大鼠等多种实验高血压模型血压[19-20]，更可降低高血压病人血压[21]，其降压机制涉及广泛，可能与调节热休克蛋白70/ERK/PPARγ信号通路、抑制氧化应激、螯合锌离子抑制血管紧张素转换酶活性、降低ET-1而促进内皮依赖的血管舒张功能、增加NO等有关。山奈酚是槲皮素的代谢产物，对阻力动脉的舒血管效力很强[22]。研究显示其可抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等炎症通路信号传导[23]，抑制还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 或Fe2+诱导的脂质微粒系统中的脂质过氧化，清除超氧化物阴离子，并能增强内外源性NO引起的血管舒张，减少氧化损伤，从而加强内皮保护[24]，以及通过沉默调节因子1(SIRT1)介导的线粒体途径，增加淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达，抑制心肌凋亡[25]。而烟碱大黄素是一种单萜类吲哚生物碱，有报道称其可能有引起血管舒张、降血压、抗动脉粥样硬化和凋亡诱导的作用[26]。β-谷甾醇是可通过结构修饰和进一步的合成制备出高血压药等几乎所有甾体药物的活性物质，可降低血清钙离子水平，保护高血压大鼠肝肾功能，具有抗炎、降压、降脂等作用[27]。本研究分子对接的结果也表明，槲皮素、山奈酚、烟碱大黄素、β-谷甾醇与主要靶点PGST2和CALM结合活性高，说明桑寄生-杜仲药对可能主要是通过这些成分发挥降压效应的。

本研究结果表明，桑寄生-杜仲药对发挥作用的靶点主要集中在PTGS2，而CALM亦是其重要靶点。PTGS2是编码环氧化酶2(COX-2)的基因，参与转化花生四烯酸(AA)为前列环素(PG)，正常状态下水平极低，在炎症状态下表达明显升高。而花生四烯酸代谢途径及其衍生物在高血压发病中有重要意义，同时对心血管活性有复杂的调节作用[28]。高血压病人体内花生四烯酸明显高于正常人，且随病情加重而加重[29]。PGE2受体(EPs)的平衡在维持正常血压中发挥重要作用，其一方面可通过降低EP1介导的Ca2+内流和EP3介导的cAMP而增加血管张力和血压[30]；同时，又可经EP2和EP4介导的cAMP合成可激活腺苷酸环化酶途径，导致血压下降[31]。CALM负责编码产生钙调蛋白，后者是多功能钙离子传感器，在钙依赖性信号传导途径中起关键作用，参与调控细胞增殖、靶酶如磷酸化酶激酶、鸟苷酸环化酶、磷脂酶A2等的调节、cAMP合成以及血管平滑肌细胞收缩活性[32]，与高血压密切相关[33]。

而桑寄生-杜仲药对干预原发性高血压的关键通路主要有神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、TNF信号通路。神经活性配体-受体相互作用包括了5-羟色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)等具有兴奋或抑制神经活性的物质与受体之间的作用。中枢与外周5-HT的活性和水平与整个脉管系统密切相关，也与高血压联系紧密[34]；而他们发挥作用的关键在于与血管上各种5-HT受体的亲和力，不同受体类型介导的作用不同。如5-羟色胺2A受体(5-HT2A)具有很强的缩血管作用[35]，而5-HT 1B/1D受体可以通过介导抑制交感神经末端释放去甲肾上腺素(NE)减弱血管收缩[36]。原发性高血压中Ca2+动员和肌丝Ca2+敏感性增强, 导致血管平滑肌过度收缩, 是高血压重要的病理生理改变之一[37]，而血管舒张、血压下降的关键在于降低细胞内钙离子浓度，减少钙诱导引起的钙释放引起的兴奋-收缩偶联，这也正是降压药Ca2+拮抗剂的作用依据。而TNF是具有免疫调节作用的小分子多肽，是炎症反应的重要媒介。高血压和高血压前期病人血清均可检测到TNF-α升高，而TNF-α不仅可通过细胞毒作用直接破坏血管内皮结构从而降低血管舒张功能，同时还可以促进强效缩血管物质ET-1的释放，并通过诱导白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等炎性因子分泌，引起血管壁重塑，阻力增高，促进原发性高血压的发生发展[38]。

综上可见，桑寄生-杜仲药对的多个活性药物组分可调控原发性高血压的多个不同靶点，而同一靶点又能作用于不同的通路和生物学过程发挥不同效应，具有多成分、多靶点、多通路、多网络的特点，作用机制复杂，后期仍需在本研究发现的基础上设计完善的动物或细胞实验对关键靶点加以验证，以弥补网络药理学的不足，并为该药对的临床应用提供更多参考。