响应面法优化黄精复合饮料的澄清工艺

王杰，周艺明，孙玉萍，袁林祥*

湖南中医药大学药学院（长沙 410208）

黄精（Polygonatum sibiricum）是百合科黄精属的草本植物，含有多糖、生物碱、多酚类等活性化成分[1]，对降血糖、降血脂[2]、抗肿瘤[3]有显著效果作用。桑椹（Fructus mori）为桑科植物桑树的果实，主要含有多糖、多酚等成分[4]，有一定抗疲劳[5]、抗氧化[6]作用。枸杞（Lycii fructus）为茄科枸杞属植物的果实，主要含有多糖、维生素、多种酚类等[7]，具有降血脂[8]、抗氧化[9]、保肝[10]、降血糖[8,11]、抗肿瘤[12]等作用。黄精具有补气、健脾作用；桑椹具有补肝功效；枸杞主要用于滋补肝肾。李安等[13]研究黄精发酵饮料的澄清工艺条件，并对发酵方式各个参数条件的工艺优化提供了参考。魏苑[14]通过探究枸杞汁澄清工艺试验，研究发现果胶酶和纤维素酶对枸杞汁具有显著澄清效果。试验采用果胶酶和纤维素酶为澄清剂，通过响应面法，探究最适用酶量及作用条件，并为其工业化生产提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄精、枸杞、桑椹：湖南亚飞中药饮片有限公司；果胶酶（5万 U/g）、纤维素酶（10万 U/g）：河南多美滋生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ATY124型岛津万分之一电子天平（日本岛津仪器有限公司）；UV1780型紫外分光光度计（日本岛津仪器有限公司）；ST3100型pH计[奥豪斯仪器（常州）有限公司]；HH-6S型水浴锅（巩义中天仪器科技有限公司）；YP6002型电子秤（上海天佑仪器有限公司）；Cenlee 16K台式高速离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）。

1.3 黄精饮料制备工艺流程

1.3.1 工艺流程

黄精、桑椹、枸杞提取→澄清→调配→均质→杀菌→检测→灌装→冷却→检测→成品

1.3.2 操作要点

分别称取上述黄精、枸杞、桑椹质量比15︰15︰10（总量40 g）置于烧杯中，量取1 000 mL蒸馏水浸泡30 min。煮沸后转至小火微沸30 min，冷却至室温，过滤；继续将原料置于烧杯，加800 mL水后重复上述操作，将2次原液混合，并以蒸馏水稀释4倍作为样品进行下一步试验。

1.4 最佳透光率的确定。

以蒸馏水为参比，紫外分光光度计波长λ为290~990 nm，加入样品对其透光率进行波长扫描，结果如图1所示，约在800 nm处取到最大值80.3%。故确定测定波长为800 nm[15-16]。

图1 波长扫描图

1.5 样品透光率的单因素试验

针对该样品澄清的单因素试验，进行酶种类、温度、时间、酶用量、复合酶比例进行试验，以透光率为因变量。选定：酶种类分别为果胶酶、纤维素酶，澄清剂为壳聚糖；温度为35，40，45，50，55和60℃；时间为30，45，60，75，90，105和120 min；酶用量（每100 mL）为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 g；复合酶比例为1︰1，2︰1，3︰1，4︰1，5︰1，6︰1，7︰1和8︰1。样品pH约为5.1，处在果胶酶和纤维素酶最适范围内，保持在自然的pH条件下进行试验[17]。

1.6 样品透光率在复合澄清剂作用下的组合优化试验

研究复合酶比例对澄清效果的影响。确定复合酶总量0.2 g/100 mL、处理温度45 ℃、处理时间40 min，对不同复合酶比例（纤维素酶︰果胶酶为1︰1，2︰1，3︰1，4︰1，5︰1，6︰1和7︰1）进行考察。取100 mL样品于烧杯中并预热到预定温度，加澄清剂混合均匀处理。结束后立即取出置于电炉上加热沸腾5 min灭酶。冷却后用移液枪移取40 mL进行转速6 000 r/min离心，总计10 min。取离心后的上清液测定透光率，确定最佳复合酶比例为5︰1。

确定复合酶比例5︰1、处理温度45 ℃、处理时间40 min，对不同复合酶总量（0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 g）进行考察，最终确定复合酶总量为0.4 g/100 mL。

确定复合酶比例5︰1、复合酶总量0.4 g/100 mL、处理时间40 min，对不同处理温度（40，45，50，55和60 ℃）进行考察，最终确定最佳处理温度为45 ℃。

确定复合酶比例5︰1、复合酶总量0.4 g/100 mL、处理温度45 ℃，对不同处理时间（30，45，60，75，90，105和120 min）进行考察，最终确定处理时间为45 min。

1.7 响应面试验设计

根据单因素试验结果，应用Design-Expert V8.0.6.1软件的Box-Behnken试验设计原理进行试验，对此样品进行优化分析，以确定最佳的澄清条件。因素水平及其他条件见表1。

表1 响应面因素水平表

1.8 测定方法

采用紫外分光光度法，以蒸馏水作为参比液，在800 nm处采用紫外分光光度计测定样品透光率，以透光率作为评价澄清效果的指标。

2 结果与分析

2.1 澄清剂澄清单因素结果的分析

2.1.1 酶总量对样品透光率影响的分析

果胶酶、纤维素酶是有效的澄清剂，由于果胶往往和纤维素相互交联，性质稳定，单独使用果胶酶难以进入，导致包含的果胶难以被水解。故同时使用果胶酶和纤维素酶会起到协同作用，使外部的纤维素外壳被破坏，果胶暴露出来更容易被酶解，使得澄清效果更好[18-19]。通过预试验，在复合酶比例5︰1、处理温度45 ℃、处理时间45 min时探究复合酶添加量对透光率的影响，由图2可以看出，随着酶总量逐渐增大，透光率上升明显，但酶总量超过0.4 g时即不再增大，在超过0.5 g时逐渐开始下降，可能由于酶总量过大造成返浑现象，过多的澄清剂会悬浮于样品而造成透光率下降[20]，因此在考虑澄清效果的同时考虑经济问题，选择复合酶总量0.4 g为宜。

图2 酶总量单因素试验验结果

2.1.2 复合酶比例对样品的透光率影响的分析

确定复合酶总量0.4 g、处理温度45 ℃、处理时间45 min条件下，探究复合酶比例对这款黄精制品澄清效果的影响。由图3可知，随着纤维素酶︰果胶酶比值增大，在1︰1~5︰1范围内透光率呈上升趋势，超过5︰1后透光率趋于稳定。

图3 复合酶比例单因素试验结果

2.1.3 复合酶处理温度对样品透光率影响的分析

选择复合酶总量0.4 g、复合酶比例5︰1、处理时间45 min，按照温度梯度40~65 ℃进行试验，由图4可知：开始随着温度上升透光率增大且45 ℃时最大；温度45~55 ℃时，透光率略微下降，但趋于稳定；55~65 ℃透光率明显下降至40 ℃时的状态，但整体透光率仍然高于室温（25 ℃）下初始透光率（80.3%）。可能由于温度过高超过果胶酶和纤维素酶最适温度导致活力降低，但温度未达到灭活温度，由于热凝固作用导致透光率再次降低[21]。因此选定最适处理温度为45 ℃。

图4 温度处理试验结果

2.1.4 复合酶处理时间对样品透光率影响的分析

选择复合酶添加量0.4 g、复合酶比例5︰1、处理温度45 ℃，按照时间梯度30~120 min进行试验，由图5可知，随着处理时间延长，透光率逐渐增大，45 min时达到最大，稳定在88.4%左右，可能由于酶将底物分解完全，形成絮凝物，导致透光率不变化，随着时间延长，一部分絮凝物溶解，导致透光率稍有下降[22]。

图5 时间处理试验结果

2.2 样品澄清的响应面优化结果及其分析

2.2.1 样品响应面分析的回归模型的显著性检验和方差分析

以Design-Expert对数据进行多元回归拟合，最终得到透光率（Y）的二次多项回归方程：Y=88.78+0.57A+0.35B-0.71C-0.51D-0.28AB-0.15AC+0.47AD-0.075BC+0.30BD+0.20CD-0.34A2-0.39B2-0.62C2-0.42D2。

由表3可知：响应面的模型及显著（p＜0.01），4个一次项A（复合酶总量）、B（复合酶比例）、C（处理温度）、D（处理时间）均极显著，B显著（p=0.000 3＜0.05）；二次项A2，B2，C2，D2均极显著；在交互项中AB，BD均显著，AD极显著；失拟项系数为p=0.151 7＞0.05不显著。其中，回归模型的决定系数为0.956 1，说明回归方程拟合度较好，较好地反映各条件与样品透光率之间的作用关系的规律。由表4可以看出，方差数据中，拟合度系数R2为0.956 1，与校正拟合度系数Radj2接近，相差约0.4，说明模型和实际拟合度好，试验和模型相符。预测拟合度Rpred2=0.768 9，表示预测性比较好。变异系数（C.V.）＜5%，具有很好重现性，而信噪比＞4也说明该模型精确度较好[23]。

表2 响应面试验验结果

表4 方差相关系数

表3中的F值显示，4个因素的影响次序从大到小为C＞A＞D＞B，即处理温度＞复合酶添加量＞处理时间＞复合酶比例。

表3 回归模型显著性分析

图10 处理温度与复合酶比例交互关系

2.2.2 样品澄清的响应面各因素交互作用的分析

响应面的三维立体图映射到底面的等高线图越圆则说明其因素交互作用较弱，越靠近椭圆形则说明交互作用较强[24]。图7和图11均近似呈椭圆形，说明交互作用显著。图9呈椭圆形，说明交互作用极显著。由图6和图8可得，随着复合酶总量的增大，透光率是先增大后下降的趋势，可能由于过量的酶未参与反应造成反浑反应，产生二次浑浊[25]。

图6 复合酶总量和处理时间交互关系

图7 复合酶总量和处理时间等高线

图8 复合酶比例和复合酶总量交互关系

图9 复合酶比例和处理时间等高线图

图11 复合酶总量和比例等高线图

3 结论

结果表明，纤维素酶、果胶酶对黄精饮品具有较好澄清效果。4个因素作用的影响大小是处理温度＞复合酶总量＞处理时间＞复合酶比例。采用响应面得出的最佳工艺条件为复合酶添加量0.48 g、纤维素酶︰果胶酶=4.88︰1，处理温度46.87 ℃，处理时间43.02 min，考虑可操作性对数据进行优化，选择复合酶添加量0.48 g、纤维素酶︰果胶酶=5︰1、处理温度47 ℃、处理时间43 min进行3次平行试验，最后得出透光率为89.4%，与响应面优化设计预测结果89.139 7%相差约0.3个百分点，说明响应面模型的预测性良好，模型较好地反映出各个因素与透光率之间关系。澄清试验对这款黄精复合饮料的澄清工艺做出优化，对其工艺具有指导作用。