彝药露水草中β—蜕皮激素的提取工艺研究

郭菊玲++杨勇帮++赵玉梅

摘要：目的采用纤维素酶法及澄清工艺提取彝药露水草中β-蜕皮激素。方法纤维素酶法：加入纤维素酶，从其影响因素pH值，酶加入量，酶解温度及酶解时间入手，采用L9（34）的正交试验设计，分析实验结果得出最优提取工艺流程；澄清工艺：加入不同类型及不同比例的澄清剂。结果pH值45，酶加入量9 mg，酶解温度40℃，酶解时间30 min；壳聚糖澄清剂及ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂A：B（2：8）澄清效果最佳。结论该工艺提取过程简单、高效、节约成本，为改进生产企业从露水草中提取β-蜕皮激素的提取工艺提供参考依据。

关键词：β-蜕皮激素；提取；纤维素酶；澄清剂；峰面积；透光率；提取工艺

中图分类号：R2842文献标志码：B文章编号：1007-2349（2017）07-0070-04

露水草（Cyanotis arachnoides CBClarke）又名珍珠露水草，鸡冠参等，属鸭跖草科蓝耳草属多年生草本植物，其根可以入药，夏秋采集，洗净，鲜用或晒干。露水草有祛风活络，利湿消肿，退虚弱等功效。用于风湿性关节炎，腰腿痛，肾炎水肿，虚热不退；外用治湿疹，脚癣，刀伤。随着科学研究的进步，近年来对露水草有效成分的研究也越来越深入，露水草中含有的β-蜕皮激素被广泛用于养殖、保健、化妆品、医药行业[1]。

蜕皮激素作用于人体有促进胶原蛋白合成、抗心律不齐、抗疲劳；促进细胞生长、刺激真皮细胞分裂，排除体内的胆固醇；降血脂，抑制血糖上升；通经活络，除湿镇痛，等生理活性。是天然的抗癌制剂。露水草蜕皮激素自1976年问世以来，已研制不定期片剂、针剂、膏剂。民间用于风湿性关节炎，治疗不同症状的风湿及关节炎患者有较好疗效，其有效成分20-羟基蜕皮甾酮经临床研究证明具有直接降血糖作用，对II型糖尿病总有效率84%，对改善糖尿病患者“三多一少”症状尤为明显。

在运动保健品方面，蜕皮激素具有显著的通过增加氨基酸装配成蛋白链，从而刺激肌肉细胞质中蛋白质合成的能力，而且该能力回溯至蛋白质生长的转译和迁移过程。蜕皮激素不仅有益于健康而且安全，其有助于稳定在皮质醇伤害时的细胞，使能量合成步骤正常化（ATP和肌氨酸）和改善肝功能從而使有机体能迅速地适应环境和压力变化。其安全性很高，经超过50次的研究显示蜕皮激素没有副作用，没有与荷尔蒙的相互作用，毒性水平也极低。当1998年ICN生化实验室对其进行测试时，数据显示蜕皮激素要显示出毒性必须达到6400 mg/kg的超高剂量。而且，在包含测试睾固酮，皮质醇，胰岛素，促皮质素，生长激素和黄体生成激素的内分泌测试中，没有任何蜕皮激素对哺乳动物荷尔蒙系统作用的报道。

在蚕业养殖上，用于促使桑蚕龄期缩短，上簇整齐，促进吐丝结茧；蜕皮激素是水生甲壳类——虾、蟹类生长发育、脱壳变态所必须的物质，是“脱壳素”的主要原料；该品适用于虾、蟹等水产甲壳类及地憋虫的人工养殖，添加该品后可使虾、蟹顺利脱壳，促进虾、蟹类脱壳的一致性，有效避免个体间的互相残杀，显著提高养殖成活率和商品规格。

在化妆品上，一般使用的是经过特殊处理后的高纯度的蜕皮激素也叫“蜕皮甾酮”，呈纯白色结晶性粉末或无色的透明结晶体，成分单一，对皮肤无过敏反应，具有很强的渗透性，在液态状态下能快速被皮肤吸收；能增强细胞新陈代谢及活化的有效物质，具有良好的去角质、去斑增白作用，对面部黄褐斑、外伤性黑斑、雀斑、黑色素沉着等有很好的修复功效，另对粉刺亦有明显效果。

可见β-蜕皮激素药用价值极高，成为科学研究的一个热点，因此，从露水草中如何高效地提取β-蜕皮激素成为了研究的关键。

本实验为了探索从露水草中提取β-蜕皮激素的最佳工艺流程，试图采用纤维素酶法[2]及澄清工艺进行提取[3-6]。从影响酶解的因素：PH值、酶加入量、酶解时间及酶解温度入手，通过实验得出一个最优的提取工艺流程。

1材料和方法

11试验材料及试剂露水草干粉，β-蜕皮激素（北京坛墨质检科技有限公司 北京北化恒信生物技术有限公司20140722），纤维素酶（国药集团化学试剂有限公司20150107 酶活力/（U/g>150000）），ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂A组分（北京正天成澄清技术有限公司），ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂B组分（北京正天成澄清技术有限公司），壳聚糖，冰醋酸，醋酸钠，氢氧化钠试液，70%乙醇，纯化水，乙腈。

12仪器与设备电子天平（赛多利斯BSA224S-CW），电子天平（赛多利斯BP211D-OCE），三合一电极酸度计（ORION 3 STAR Thermo ELECTRON CORPORATION），超声波清洗仪（CPXS800H-C 心能信超声上海有限公司），高效液相色谱仪（安捷伦1260DAD），高速台式离心机（TGL-10B 上海安亭科学仪器厂），紫外可见分光光度计（安捷伦Cary60），流水式粉碎机（YE3-1 永历制药机械有限公司），水浴振荡器（SZX-B金坛市大地自动化仪器厂），数显恒温水浴锅（XMTD 余姚市亚星仪器仪表有限公司）。

13纤维素酶法取露水草干粉各1 g，加入所设酶加入量，精密加所设pH值的醋酸-醋酸钠缓冲溶液25 mL，按所设温度及所设浸渍时间处理样品，再将各样品超声处理30 min，之后将各样品进行离心（3000 r 10 min）处理，精密量取上清液2 mL，水浴锅上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定，ZORBAX SB-C18柱（150mm×46 mm），流动相乙腈-水（17：83），柱温30℃，流速10 mL/min，检测波长240 nm。

14澄清工艺

141ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂的配制A组分溶液：称取10 gA组分细粉，先用少量水溶解，充分搅拌成糊状，再加水至100 mL，溶胀24 h以上，搅拌，制成1%的粘胶液。

B组分溶液：称取10 gB组分细粉，先用少量1%醋酸溶液溶解，充分搅拌成糊状，再加1%醋酸溶液至100 mL，溶脹24 h以上，搅拌，制成1%的粘胶液。

142壳聚糖澄清剂的配制称取10 g壳聚糖细粉，先用少量1%醋酸溶液溶解，充分搅拌成糊状，再加1%醋酸溶液至100 mL，溶胀24 h以上，搅拌，制成1%的粘胶液。

143试验方法分别称取样品8份，每份各10 g，精密加pH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液25 mL，48℃浸渍05 h，超声处理30 min，1号样品作为空白对照，2号样品加入A组分1 mL，3号样品加入B组分1 mL，4号样品加入壳聚糖1 mL，5-9号样品依次按AB组分溶液比例为2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分别先加入B组分溶液为：08 mL、06 mL、05 mL、04 mL、02 mL，振摇30 min，再加入A组分溶液为：02 mL、04 mL、05 mL、06 mL、08 mL，继续振荡15 h，过滤，采用紫外分光光度法测定。

2纤维素酶法影响因素分析及结论

21pH值的影响取露水草干粉各1 g，加入酶各6 mg，精密加25 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，pH值为35、40、45、50、55、60，48℃浸渍15 h，再将各样品超声处理30 min，之后将各样品进行离心（3000r 10 min）处理，精密量取上清液2 mL，水浴锅上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定[1]。测定结果见表1、图1。

结果分析：由A1：A2=C1：C2得出峰面积与浓度成正比，根据上图趋势可以看出，控制变量条件下pH=5为最佳酶解pH值。

22酶加入量的影响取露水草干粉各1 g，酶加入量为4，6，9，15，18，20 mg，精密加pH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液25 mL，48℃浸渍15 h，再将各样品超声处理30 min，之后将各样品进行离心（3000 r 10 min）处理，精密量取上清液2 mL，水浴锅上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定。测定结果见表2、图2。

结果分析：根据上图趋势可以看出，控制变量条件下18 mg为最佳酶加入量。

23酶解温度的影响取露水草干粉各1 g，酶加入量为6 mg，精密加pH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液25 mL，分别设定温度为20，30，40，50，60℃，浸渍15 h，再将各样品超声处理30 min，之后将各样品进行离心（3000 r 10 min）处理，精密量取上清液2 mL，水浴锅上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定。测定结果见表2、图3。

结果分析：根据上图趋势可以看出，控制变量条件下，50℃为最佳酶解温度。

24酶解时间的影响取露水草干粉各1 g，酶加入量为6mg，精密加PH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液25 mL，48℃浸渍05 h，10 h，15 h，20 h，25 h，30 h，再将各样品超声处理30 min，之后将各样品进行离心（3000 r 10 min）处理，精密量取上清液2 mL，水浴锅上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定。测定结果见表4、图4。

结果分析：根据上图趋势可以看出，控制变量条件下，05 h为最佳酶解时间。

25正交试验当影响一个实验的因素太多时，我们应该考虑利用正交试验选择一部分有代表性的点水平组合进行试验，从而对诸多的影响因素进行综合分析，以便于考虑各个因素之间的相互关系。正交试验就是利用排列整齐的表——正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。

本实验主要探究纤维素酶法提取露水草中β-蜕皮激素的四个参数：PH值（A），酶加入量（B），酶解温度（C）及酶解时间（D）对提取率的影响。采用L9（34）的正交试验设计，力求找到纤维素酶法提取β-蜕皮激素的最佳工艺流程。本次试验采取β-蜕皮激素的峰面积为评价指标来选择最佳提取条件。正交试验结果见表5。

结果分析：从正交试验极差分析可知，pH值，酶加入量，酶解温度，酶解时间对β-蜕皮激素提取率的影响程度为：酶解温度>酶解时间>pH值>酶加入量。最佳酶解条件为A1B3C2D1，即PH值为45，酶加入量为9 mg，酶解温度为40℃，酶解时间为05 h。

3澄清剂的选择

31高效液相色谱法测定分别称取样品8份，每份各10 g，精密加pH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液25 mL，48℃浸渍05 h，超声处理30 min，1号样品加入A组分1 mL，2号样品加入B组分1 mL，3号样品加入壳聚糖1 mL，4-8号样品依次按A、B组分[7]溶液比例为2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分别先加入B组分溶液为：08、06、05、04、02 mL，振摇30 min，再加入A组分溶液为：02、04、05、06、08 mL，继续振荡15 h，离心（3000 r 10 min）处理，精密量取各样品上层清液2 mL，水浴锅上蒸干，用70%的乙醇溶解，定容至50 mL，微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定。测定结果见表6、图5。

结果分析：通过比较使用不同组分澄清剂的各个样品的峰面积，可以看出澄清剂的加入不影响其提取率。

32紫外可见分光光度法测定分别称取样品8份，每份各10 g，精密加PH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液25 mL，48℃浸渍05 h，超声处理30 min，1号样品作为空白对照，2号样品加入A组分1 mL，3号样品加入B组分1ml，4号样品加入壳聚糖1 mL，5-9号样品依次按AB组分溶液比例为2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分别先加入B组分溶液为：08、06、05、04、02 mL，振摇30 min，再加入A组分溶液为：02、04、05、06、08 mL，继续振荡15 h，过滤，采用紫外分光光度法测定。测定结果见表7、图6。

结果分析：根据图表可以看出壳聚糖及ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂A：B（2：8）澄清效果最佳，而静置时间对其澄清效果影响不明显。

4小结

采用纤维素酶法及澄清工艺提取彝药露水草中β-蜕皮激素实验中，通过L9（34）的正交试验设计，分析实验结果得出最优提取工艺流程：pH值45，酶加入量9 mg，酶解温度40℃，酶解时间05 h。通过加入不同类型及不同比例的澄清剂，分析结果得出壳聚糖澄清剂及ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂A：B（2：8）澄清效果最佳，而静置时间对澄清效果影响不明显。

参考文献：

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[4]段冬洋，曾晓房，吴笠，等山楂酒功能成分浸出物规律及其澄清工艺研究[J].酿酒科技，2014，3：18-20

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[6]陈悦壳聚糖在当归补血口服液澄清工艺中的应用[J].中国民族民间医药，2015，9：11

[7]冯传平，杨慧，李辉，等KBT-ZTC澄清剂用于补肾温肺合剂水提液的澄清工艺研究[J].中成药，2015，5：1127-1130