酵母可同化氮类型对桑葚酒发酵的影响

谢克英 ，刘冠慧*，钱志伟，石明生，岳丽敏，乔宝营

1.河北工程大学生命科学与食品工程学院（邯郸 056038）；2.河南农业职业学院食品工程学院（郑州 451450）

桑葚含有糖、蛋白质、维生素等营养元素[1]和多糖、黄酮、花色苷、生物碱[2]等多种功能活性成分，具有很高的营养价值和药用价值。成熟桑葚质地柔嫩，不耐贮运，易腐烂变质，难以满足市场需求。近年来果桑发展迅速，果实采摘、销售不及时造成大量损失。将桑葚进行加工是提高其经济价值的有效方法，常见的加工产品有果酒[3]、果汁[4]、果酱[5]等。桑葚酒保留桑葚果实中黄酮、多酚、花色苷、生物碱等生物活性物质，受到广泛关注[6-8]。生产中提高桑葚酒发酵速度，缩短发酵时间，从而提高设备利用率，加快桑葚处理速度，可以有效缓解桑葚不易贮藏的难题。发酵过程中菌种选择和繁殖条件都可以影响发酵速度。酵母菌在酿酒过程中利用糖、氨基酸、无机盐、有机酸、维生素等营养物质进行生长、繁殖和代谢，将糖转化成乙醇。这些营养物质中氮元素是关键物质之一，酵母菌能够直接利用的氮主要有游离α-氨基酸态氮、小分子肽和游离铵离子，称为酵母可同化氮。研究发现葡萄酒发酵过程中添加可同化氮可以显著提高葡萄酒发酵速度和乙醇产量[9]。添加可同化氮对葡萄酒发酵影响的研究较多，桑葚酿酒过程中添加可同化氮也有相关报道[10]，但添加可同化氮对桑葚酒发酵的影响尚未见系统的研究报道。试验以桑葚原浆为原料，通过添加不同类型氮源提高可同化氮含量，测定发酵过程中的理化指标，研究可同化氮类型对桑葚酒发酵的影响，为桑葚酒生产中补加可同化氮提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚原浆（5月份采摘新鲜成熟桑葚，采摘后迅速带回实验室，于-20 ℃保存）；酿酒酵母（活性干酵母，La Bayanus，法国Oenofrance公司）。

果胶酶、偏重亚硫酸钾、山梨酸钾（烟台帝伯仕有限公司）。

1.2 仪器与设备

可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；EX31生物显微镜[舜宇光学科技（集团）有限公司]；pH计（上海雷磁仪器有限公司）；离心机（湖南湘仪离心机有限公司）；破壁机（山东九阳小家电有限公司）；GC7900气相色谱仪（天美科技有限公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（美国Supelco公司）；7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪（GCMS，安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

桑葚酒酿造工艺流程：桑葚解冻、去梗、清洗、晾干，破壁机打浆，桑葚原浆按照13 g/100 g添加蔗糖，按照120 mg/kg和30 mg/kg分别加入偏重亚硫酸钾和果胶酶，按照0.02%接种活性干酵母。将匀浆分装到15个1 L三角瓶中，每瓶装500 g处理后的桑葚原浆。三角瓶用棉塞封口，发酵温度为21 ℃，还原糖含量基本保持不变时，加入320 mg/kg偏重亚硫酸钾和200 mg/kg的山梨酸终止发酵。

试验设添加硫酸铵、谷氨酸、色氨酸、丙氨酸、不添加（CK）5个处理，可同化氮添加量为150 mg N/kg。

1.4 测定方法

发酵过程中酵母菌数量采用血球计数板计数法，还原糖含量采用DNS法，可同化氮含量采用甲醛值法。

乙醇含量采用气相色谱法[11]，乙醇含量测定采用ZKAT FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛细管色谱柱。载气为氮气，流量5 mL/min，空气流量380 mL/min，氢气流量30 mL/min。色谱柱初温45 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至50 ℃，保持5 min，以20 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；分流比25︰1，进样口温度250 ℃，FID温度280 ℃，尾吹气氮气流量30 mL/min，进样量1 μL。

样品中高级醇包括异丙醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、β-苯乙醇，采用顶空固相萃取-气相色谱-质谱法（HS-GC-MS）进行测定，参考李智慧等[12]的方法，略有改动。处理条件：向20 mL顶空瓶中加入20 μL 210 mg/L的2-辛醇内标、3 g NaCl、转子和10 mL发酵液，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，用PTFE垫密封，并置于磁力搅拌器上，在350 r/min条件下搅拌，在45 ℃下预热10 min，吸附30 min。250 ℃解吸4 min，用于GC-MS测定。

气相色谱条件：安捷伦GC7890B气相色谱仪，安捷伦DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。色谱柱初温40 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至230 ℃，稳定1 min，以20 ℃/min升至230 ℃，稳定2 min；载气为氦气，不分流。

质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；检测器温度250 ℃；质量扫描范围m/z30~400。

2 结果与分析

2.1 可同化氮类型对酵母菌数量的影响

酵母菌生长过程需要氮源，当发酵液氮源含量较低时添加氮源有利于酵母菌繁殖[13]。发酵初期较高的糖浓度不利于酵母生长，酵母需要一个适应时期。结果表明发酵的第1天酵母菌数量各处理处于较低水平，差异不显著。发酵前3 d，各处理的酵母菌数量迅速增加，其中以添加硫酸铵处理酵母菌数量最高，达到2.83×108个/mL，添加丙氨酸、色氨酸处理酵母菌数量低于硫酸铵处理，达到2.38×108个/mL，添加谷氨酸和对照处理酵母菌最低，分别为2.18×108个/mL和2.12×108个/mL。第2天酵母菌数量各处理增加最多，说明酵母菌此时处于对数生长期，这与胡永正[3]研究结果一致。第3天后添加硫酸铵处理酵母菌数量不变，其他处理缓慢提高，但增加速度慢，说明添加硫酸铵处理酵母菌生长进入稳定期，其他各处理酵母菌数量继续提高，但增速显著低于前3 d。随后各处理酵母菌数量基本保持不变。酵母发酵过程中添加可同化氮可以提高酵母生长速率，但酵母菌对不同氮源利用有选择性[14]，试验结果表明其优先利用硫酸铵态氮源，其次为丙氨酸、色氨酸类氮源，对谷氨酸利用较低（图1）。

图1 可同化氮类型对酵母菌数量的影响

2.2 可同化氮类型对还原糖利用的影响

桑葚汁发酵过程中，酵母菌将发酵液中糖转化成乙醇，还原糖含量降低，还原糖含量受酵母菌数量影响。还原糖为发酵过程提供能量和碳源，还原糖含量可以作为发酵进程的指标。第1天还原糖含量添加硫酸铵处理降低最大，低于200 mg/L，与其他处理差异显著。第1天对照和添加其他氮源处理还原糖降低缓慢，高浓度还原糖产生较高渗透压，抑制酵母菌的生长，因此酵母菌含量较低[15]，从而影响还原糖转化。第1天以后，添加硫酸铵处理还原糖含量降低量最大，显著高于其他添加处理。添加谷氨酸和对照处理还原糖含量降低量最小，添加丙氨酸和色氨酸处理还原糖含量降低量居于中间。添加硫酸铵处理在发酵第4天后还原糖含量低于5 mg/L，对照和添加其他氮源处理第5天后还原糖含量低于5 mg/L。各处理间的变化趋势与酵母菌数量变化的趋势相关（图2）。

图2 可同化氮类型对还原糖质量浓度的影响

2.3 可同化氮类型对可同化氮利用的影响

酵母生长过程中可以利用游离氨基酸和铵离子等可同化氮源，对不同的氮源利用有选择性。发酵前3 d，可同化氮含量大幅度下降至最低点；随后可同化氮含量趋于稳定。添加硫酸铵处理，可同化氮含量显著降低，其他处理和对照差异不显著。酵母数量进入稳定期后，可同化氮含量开始保持稳定（图3）。发酵液添加氨基酸后，氨基酸被酵母吸收，然后合成作为细胞骨架的各种蛋白质和酶类[16]。不同氨基酸吸收、合成不同，葡萄酒酿造过程中研究发现丙氨酸、色氨酸先被迅速消耗，后面又生成，谷氨酸迅速消耗后，后面不再生成[17]。不同葡萄汁氨基酸含量差异大，酵母种类不同，发酵条件不同都会影响到酵母对氮源的吸收和生成[18-19]。桑葚和葡萄汁中氨基酸含量与组成不同。因此，试验结果中添加谷氨酸处理虽然酵母菌数量和还原糖含量与添加丙氨酸、色氨酸差异显著，但可同化氮含量和添加丙氨酸、色氨酸差异不显著。

图3 可同化氮类型对可同化氮利用的影响

2.4 可同化氮类型对乙醇生成量的影响

添加硫酸铵处理第3天后乙醇生成量显著高于其他处理，第5天后可达12.89%。添加丙氨酸、色氨酸处理从第5天后高于对照处理和添加谷氨酸处理。添加谷氨酸处理和对照乙醇生成量无差异（图4）。张斌等[20]研究发现荔枝酒发酵前添加谷氨酸或谷氨酸和精氨酸的混合氨基酸可以明显提高发酵速率，促进酵母生长、增大乙醇产率。商玉荟等[21]研究发现荔枝酒发酵前添加不同种类与浓度的氨基酸可以加快可溶性固形物的消耗速率，提高总醇类含量。黄酒发酵添加不同氨基酸的研究结果表明添加谷氨酸对乙醇产量无显著影响。不同试验结果可能与发酵条件、菌种、发酵原料中氨基酸含量不同有关[12]。

图4 可同化氮类型对乙醇生产量的影响

2.5 可同化氮类型对高级醇的影响

果酒酿造过程中通过支链氨基酸分解以及糖代谢合成途径都可以产生各种高级醇[22]。高级醇本身构成果酒的风味，与乙酸等酸反应生成酯类也影响果酒风味，含量低果酒风味寡淡，含量过高辛辣刺激感重，容易致醉（俗称上头）。高级醇中含量最高的是异丁醇和异戊醇[23]，果酒内高级醇含量最好不要超过400 mg/L[24]。通过敲除支链氨基酸转氨酶基因，可有效降低酿酒酵母中高级醇的生成量[25]。试验结果表明不同可同化氮添加处理影响高级醇的生成，高级醇类型中异丁醇和异戊醇含量高，丙醇和苯乙醇含量较低。添加硫酸铵处理显著降低丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇含量，添加谷基酸处理高级醇含量与对照无差异，不同氨基酸添加间丙醇、苯乙醇含量差异不显著。添加丙氨酸和色氨酸处理与谷氨酸处理和对照处理异丁醇和异戊醇含量差异显著（表1）。孙时光等[26]研究发现添加丙氨酸、精氨酸和磷酸氢二铵后可以显著降低桑葚酒高级醇含量，谷氨酸效果不明显，试验结果与之相似。李智慧等[12]研究可同化氮素对黄酒酵母产高级醇的影响，结果发现氯化铵等无机氮素降低高级醇的效果最好，添加苯丙氨酸产生更多高级醇，添加谷氨酸可以降低高级醇含量，原因与黄酒中氨基酸组成和发酵采用酵母差异有关。商玉荟等[21]在荔枝酒中添加不同氨基酸的研究结果表明，在中高质量浓度的精氨酸与谷氨酰胺处理之后，正丙醇的含量有着较明显增加，而丙氨酸处理则没有明显变化，不同氨基酸对高级醇影响不同。

表1 可同化氮类型对高级醇的影响 单位：mg/L

3 结论

桑葚酒发酵前，添加150 mg N/L不同类型可同化氮后，硫酸铵能促进酵母生长，加快还原糖消耗，提高可同化氮的消耗，提高乙醇产量，降低高级醇含量。丙氨酸和色氨酸能够促进酵母生长，加快还原糖消耗，但对可同化氮消耗影响不显著，提高乙醇含量和降低高级醇含量效果低于硫酸铵处理。添加谷氨酸对酵母生长、还原糖消耗、乙醇产量和高级醇含量均无影响。酵母可同化氮类型影响桑葚酒发酵，添加硫酸铵有利于桑葚酒生产。