Ad-apoptin通过AMPK/ACC信号通路抑制肺癌细胞脂代谢①

宋高杰 尚 超 李一权 朱羿龙 金宁一 李 霄（延边大学医学院，延吉 133002）

肺癌是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，数据显示2020 年我国肺癌新发病例82 万例，死亡病例71 万例（http：//gco.iarc.fr）。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要组织类型，约占所有肺癌的80%［1］。在恶性肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞需要摄取及合成大量的脂类物质以满足其细胞生理活动及合成细胞膜主要组成成分［2］。研究表明肿瘤细胞普遍存在糖脂代谢紊乱现象，即Warburg 效应，表现为摄入葡萄糖量增高、糖酵解活性增强和乳酸堆积。脂代谢异常在肺癌、乳腺癌、结肠癌和其他肿瘤中被广泛研究［3-5］。最近研究发现通过降低肺癌ACSS2 介导的乙酰辅酶A活性和组蛋白H4乙酰化抑制脂质合成，从而抑制肺癌细胞生物学功能的新机制［6］。因此，降低肿瘤细胞脂代谢为治疗肺癌提供了新的研究思路。

凋亡素（apoptin）是鸡贫血病毒VP3 基因的产物，是一种长13.6 kD 的小蛋白，具有选择性杀伤多种人类肿瘤或转化细胞的能力，对正常细胞没有毒性作用［7］。在先前的研究中，本课题组构建了表达Apoptin的重组人5型腺病毒，并将其命名为Ad-VP3（Ad-apoptin），已被证明可在肿瘤细胞中有效的表达Apoptin［8］。AMPK 是细胞能量感应和恢复代谢平衡的关键调节因子[9]。而ACC 是AMPK 的底物，为脂肪酸的生物合成提供丙二酰辅酶A 底物，丙二酰辅酶A 被磷酸化关闭，被去磷酸化激活[10]。本研究中，首次发现AMP 激活的蛋白激酶（AMPK）-乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）信号通路与Ad-apoptin 诱导的肺癌细胞凋亡密切相关。从机制上讲，Ad-apoptin 激活肺癌细胞中的AMPK，进而触发凋亡和ACC 抑制。抑制ACC 有助于Ad-apoptin 降低细胞脂代谢，从而增强细胞凋亡。以上结果表明，Ad-apoptin 通过AMPK/ACC 信号转导脂代谢来促进肺癌细胞凋亡，为研究脂代谢重编程与细胞凋亡之间的相互作用提供了新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、病毒和动物 A549 和NCI-H23 细胞系购自上海生物科学研究所细胞库。重组溶瘤腺病毒（Ad-mock 和Ad-apoptin）由实验室（中国农业科学院长春兽医研究所）构建并保存。雌性BALB/c裸鼠购自中国军事医学科学院实验动物中心，所有动物实验方案均由中国农业科学院长春兽医研究所动物护理与使用委员会（IACUC）批准。所有手术均在戊巴比妥钠麻醉下进行，符合标准实验动物操作程序。

1.1.2 主要试剂 CCK-8 试剂盒（日本同仁化学，货号：CK04）；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD 生物科技，货号：556547）；riboFECT CP（Ribobio，货号：C10511-05）；PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%）（上海雅酶生物科技，货号：PG112）；MinuteTM总蛋白提取试剂盒（Invent Biotechnologies，货号：SD001/SN002）；Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody Sampler Kit（CST，货号：8335T）；改良油红O染色试剂盒（碧云天，货号：C0158S）；三酰甘油（triglyceride，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TC）（南京建成，货号：A111-1-1 和A110-1-1）；PARP（CST，货号：9532s）；TOFA（MCE，货号：HY-101068）；AMPK（CST，货号：5831）；Apoptin（Abcam，货号：ab193612）。

1.1.3 主要仪器 SUNRISE 多功能酶标仪购自瑞士Tecan 公司；蛋白印迹电泳仪、转膜仪和显影仪购自美国Bio-Rad 公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus 公司；Accuri C6 Plus 流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 取对数期NSCLC A549 和NCIH23细胞，以5×105个/孔接种于6孔板。当达到60%融合时，根据riboFECT CP 说明书分别将si-NC 和si-AMPK 质粒转染到细胞中。转染48 h 后，收集细胞用于后续测定。

1.2.2 Western blot 用MinuteTM总蛋白提取试剂盒从肺癌细胞（A549 和NCI-H23）中提取总蛋白后用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白30µg 通过10%SDS-PAGE 分离后，转至PVDF 膜（0.45 µm）上。用5%BSA 快速封闭液封闭20 min，加入PARP、FASN、Lipin1、ACSL1、AceCS1、p-ACL等兔来源的单克隆一抗（1∶1 000 稀释）4℃孵育过夜，TBST 清洗4 次，每次8 min，加入对应山羊抗兔二抗（1∶3 000 稀释）室温孵育40 min，用TBST 清洗4 次，每次8 min，然后，滴加ECL显色并曝光拍照。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 用预冷PBS 清洗收集的细胞，向细胞沉淀中加入1×Binding Buffer工作液并重悬细胞，将细胞浓度调整至1×106个/ml。取200 µl 细胞悬液，离心后加入300 µl 含有5 µl Annexin V-FITC 和10µl PI的1×Binding Buffer，避光室温孵育20 min后用流式细胞仪检测。

1.2.4 油红O染色 取处理后的细胞，加入染色洗涤液覆盖细胞20 s，吸除染色洗涤液，加入适量油红O 染色工作液，避光染色15 min 后用PBS 清洗2 次，在倒置显微镜下观察细胞脂质积累情况。

1.2.5 TG和TC 含量测定 将A549 和NCI-H23 细胞以6×105个/孔的浓度分别接种到6 孔板中，在37℃、5%CO2下培养18 h，分别感染150 MOI Ad-mock和Ad-apoptin。按照说明检测细胞TG和TC相对含量。

1.2.6 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP） 将含有蛋白酶抑制剂的预冷IP 细胞裂解液加入至收集的细胞中，4℃裂解30 min，离心后用BCA法测定蛋白浓度，取上清液变性后用于input。向对照（Control）组蛋白上清液中加入1.0 µg IgG 和20 µl Protein A/G 珠子，Ad-apoptin 组加入20 µl Protein A/G 珠子，4℃孵育1 h；离心后取上清，加入抗体后4℃孵育过夜；加入80 µl Protein A/G-珠子，4℃孵育2 h；离心后收集免疫沉淀复合物；将免疫沉淀复合物用1 ml 预冷的IP 裂解液（不含抑制剂）洗涤4 次，每次离心后吸去上清液，加入80µl 1×还原型上样缓冲液，沸水煮10 min，离心取10µl 上清用于Western blot检测。

1.2.7 动物实验 在每只裸鼠右腿皮下接种NSCLC A549 细胞1×107个，接种7 d 后出现米粒大小质硬结节即为NSCLC 荷瘤小鼠模型构建成功，将建模成功小鼠随机分为Control 组和Ad-apoptin 组。Ad-apoptin 组瘤内给药1×107PFU Ad-apoptin，Control 组瘤内注射等体积生理盐水，1 次/3 d，连续治疗4 周。第30 天时，在戊巴比妥钠麻醉下颈椎脱位法处死裸鼠，完整取出皮下肿瘤，免疫组化检测Ki-67，TUNEL，p-AMPK和FASN阳性表达。

1.3 统计学分析 数据通过Graphpad Prism 8软件进行统计学处理分析，两组比较采用Student's 法检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05代表差异有统计学意义。数据以3个或更多独立样本的表示。

2 结果

2.1 Ad-apoptin抑制肺癌细胞的活性 CCK-8结果显示，Ad-apoptin呈剂量依赖性抑制细胞增殖（图1），而空载体Ad-mock 对肺癌细胞无显著抑制作用。Ad-apoptin 在A549 和NCI-H23 细胞中处理24 h 的IC50约为150 MOI（图1），该剂量用于后续实验。

图1 Ad-apoptin抑制肺癌细胞的活性Fig.1 Ad-apoptin inhibits cell viability of lung cancer cells

2.2 Ad-apoptin 诱导肺癌细胞凋亡 为了研究Adapoptin 对肺癌细胞的细胞凋亡作用机制，采用JC-1染色法检测了Ad-apoptin 作用于A549 和NCI-H23细胞后细胞的凋亡情况。结果表明，Control 组和Ad-mock组中的大多数细胞呈红色，而在Ad-apoptin处理组（图2A）中可观察到红色荧光的消失及绿色荧光的增加，表明Ad-apoptin 具有诱导线粒体膜电位下降的能力，而线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。Annexin V-FITC/PI结果显示，Ad-apoptin 使A549 和NCI-H23 细胞的凋亡率分别增加了27.4%和33.2%（图2B）。此外，经Adapoptin 处理的这两种细胞系中，裂解的PARP 的水平升高（图2C）。以上数据表明Ad-apoptin能有效诱导肺癌细胞凋亡。

图2 Ad-apoptin诱导肺癌细胞凋亡Fig.2 Ad-apoptin induces apoptosis of lung cancer cells

2.3 Ad-apoptin 通过抑制AMPK 依赖的ACC 抑制肺癌细胞的脂质代谢 为了进一步阐明Ad-apoptin对AMPK 信号的作用，通过Western blot 检测Adapoptin 处理前后肺癌细胞脂肪酸合成代谢相关分子的变化。经Ad-apoptin 处理的A549 和NCI-H23细胞中ACC 的磷酸化水平显著增加，而FASN、Lipin1、ACSL1、AceCS1和p-ACL蛋白表达显著降低，这表明Ad-apoptin可能通过抑制ACC 活性来下调脂肪生成（图3A）。为了验证这一点，用油红O 染料对A549 和NCI-H23 细胞脂质进行染色。如图3B 所示，在没有Ad-apoptin 处理的情况下，可观察到大量脂质累积。相反，经Ad-apoptin 处理后的细胞中脂质积累明显减少（图3B）。与Control 组比较，Adapoptin 的TG（图3C）和TC（图3D）的相对含量显著降低（P＜0.01）。结果表明Ad-apoptin 主要是通过AMPK抑制ACC进而抑制肺癌细胞的脂质代谢。

图3 Ad-apoptin 通过抑制AMPK 依赖的ACC 抑制肺癌细胞的脂质代谢Fig.3 Ad-apoptin suppresses lipid metabolism of lung cancer cells by AMPK-dependent ACC inhibition

2.4 AMPK/ACC 信号通路参与Ad-apoptin 诱导肺癌细胞凋亡 本课题组研究了Ad-apoptin 在AMPK/ACC 信号通路中诱导细胞凋亡的重要性。数据显示，si-AMPK 减弱 了Ad-apoptin 诱导的p-ACC 的增加，这也显著缓解了Ad-apoptin 诱导A549 和NCIH23细胞的凋亡（图4A、C）。TOFA 可转化为TOFyl-CoA，并对ACC 产生抑制作用。TOFA 与Ad-apoptin共同作用于A549和NCI-H23细胞后，与单独处理相比，细胞凋亡增加，p-ACC 磷酸化增强（图4B、D），这表明Ad-apoptin 促进肺癌细胞的凋亡高度依赖于AMPK/ACC 信号。为了探讨Apoptin 与AMPK 的关系，进行了Co-IP 实验。结果见图4E，外源性Apoptin 被AMPK 沉淀，提示Apoptin 与AMPK 相互作用。

图4 AMPK-ACC 信号通路参与Ad-apoptin 诱导肺癌细胞凋亡Fig.4 AMPK-ACC signaling contributes to Ad-apoptininduced apoptosis of lung cancer cells

2.5 Ad-apoptin 对体内肿瘤生长的抑制作用 在A549 裸鼠移植瘤中，Ad-apoptin 组肿瘤体积明显低于Control 组（P＜0.01，图5A）。在30 d 治疗过程中，2 个实验组中的裸鼠体质量无显著性差异，说明Ad-apoptin 没有产生明显的毒性（图5B）。同时Ad-apoptin组生存率明显高于Control组（图5C）。免疫组化结果表明，与Control 组相比，Ad-apoptin 组Ki-67 蛋白表达量显著下降，而TUNEL 蛋白表达量与之相反（图5D，P＜0.01）。Ad-apoptin 组p-AMPK蛋白表达量高于Control 组，而FASN 的表达量低于Control组，与体外实验结果一致（图5E）。

图5 Ad-apoptin对体内肿瘤生长的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of apoptin on tumor growth in vivo

3 讨论

肺癌是全世界恶性肿瘤相关发病率和病死率的主要原因［11］。为了降低病死率，必须寻找一种副作用少、疗效显著的治疗方法。随着分子生物学技术的不断发展，分子靶向治疗成为人们关注的焦点。代谢重编程，包括Warburg 效应（葡萄糖摄取增加、有氧糖酵解和乳酸产生）和脂质代谢异常，在恶性肿瘤的增殖和转移中起着重要作用［12-13］。因此，分析代谢异常，寻找“代谢靶点”已成为恶性肿瘤治疗的新策略。

溶瘤腺病毒能选择性感染杀伤肿瘤细胞，已成为抗肿瘤新药的又一研究热点［14］。本课题组早期研究发现Ad-apoptin 主要针对肿瘤细胞，对正常人体细胞无副作用，安全性高［7］。在以往的研究中，发现Ad-apoptin 通过内源性途径诱导肿瘤细胞凋亡，还可以影响肿瘤细胞的自噬和增加活性氧［7，15-16］。这些与肿瘤细胞的杀伤密切相关，然而溶瘤腺病毒对肿瘤脂代谢的机制尚不清楚。本研究发现Ad-apoptin 通过AMPK 的激活和细胞凋亡在肺癌细胞中显示出很强的抗癌活性。Ad-apoptin 上调AMPK/ACC 信号通路降低脂质代谢，促进肺癌细胞的凋亡。这一新的机制探索了抑制AMPK 依赖的ACC 在Ad-apoptin 诱导的细胞凋亡中的关键作用，从另一层面揭示癌症治疗中脂代谢和细胞凋亡之间的关系（图4），与GAO 等［2］发现上调AMPK/ACC可降低胰腺癌脂代谢和诱导凋亡的研究结果一致。本次研究还发现Ad-apoptin 的治疗在裸鼠移植瘤中也取得预期的效果。

脂代谢参与许多细胞过程的调节，脂代谢紊乱在病理上与癌症有关［17］。ACC 作为脂肪酸合成的限速酶，在癌细胞的生长和存活中起着关键作用［18］。AMPK 的磷酸化将ACC 转化为非活性形式，导致脂代谢降低。在本研究中，探讨了Ad-apoptin可能通过激活肺癌细胞中的AMPK信号来提高ACC磷酸化水平。本课题组还发现敲低AMPK 基因或ACC 的失活可以减弱Ad-apoptin 诱导的细胞凋亡，提示AMPK/ACC 信号通路参与细胞凋亡。虽然肺癌细胞株和移植瘤裸鼠的研究结果足以证明AMPK-ACC 信号在Ad-apoptin 治疗中的作用和重要性，但目前的研究没有在临床上得以证实，无法确定这一分子机制是否与Ad-apoptin 在临床癌症模型中的治疗结果一致。

综上所述，研究结果探索了Ad-apoptin 靶向AMPK，在AMPK/ACC 信号通路中参与细胞凋亡的关键作用，并为肿瘤脂代谢和细胞凋亡之间的相互作用提供了新的见解。