舍曲林对肠易激综合征大鼠cAMP/PKA通路及肠道炎症反应的影响①

范红云 段志英 赵亚男 杨春春 杨明月 张 梅 霍晓辉 白 云 王 竞（河北医科大学第一医院消化内科，石家庄 050031）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是最常见胃肠道疾病之一，在多数国家成年人中发病率高达10%～20%，以慢性或复发性腹痛、腹泻、排便习惯和大便性状异常为主要症状，尚无特异性治疗方案，严重威胁患者生活质量和生命健康［1-2］。舍曲林为抗抑郁药物，随着对其药理作用的不断研究，发现其对IBS治疗效果良好，且安全性较高［3］。舍曲林和去甲替林联合作用可保护由氧化应激引起的大鼠结肠黏膜上皮细胞损伤［4］。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A（cAMP-dependent protein kinase A，PKA）是细胞内经典途径之一，在介导细胞各种刺激反应中起关键作用，可通过调节受体、离子通道、转录因子活性调节生物细胞活性。IBS 可通过cAMP/PKA 途径调节炎症因子释放、免疫系统激活和液态水代谢异常［5］。但舍曲林对IBS 大鼠cAMP/PKA 通路及肠道炎症反应的影响尚未见报道。本研究采用母婴分离加醋酸灌肠联合结直肠扩张刺激法制备大鼠IBS 模型，并给予舍曲林治疗，旨在从cAMP/PKA 通路揭示舍曲林对IBS 大鼠肠道炎症反应的影响，为IBS治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级Wistar 孕鼠8 窝购自北京唯尚立德生物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0009。实验动物使用遵循国家《实验动物管理条例》并通过动物伦理委员会批准。按照3R原则给予实验动物人道关怀照顾。饲养条件：22℃，55%湿度，12 h光/12 h暗循环。

1.1.2 主要试剂和仪器 舍曲林（50 mg，批准文号：H20051553）购自辉瑞制药有限公司；匹维溴铵（50 mg，批准文号：H20120127）购自法国得舒特公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和β-actin 鼠抗购自美国Sigma公司；蛋白提取试剂盒、ECL 显色试剂盒和BCA 蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司；cAMP、PKA、CREB、p-CREB 鼠抗和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗均购自美国Abcam 公司；酶标仪Fax-20100 购自美国INStat 公司；尼康SMZ745 光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司；蛋白凝胶成像仪、转膜仪和电泳仪购自美国Bio-Rad 公司；脱水机、包埋机、石蜡切片机和染色机均购自湖北惠达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 IBS大鼠模型构建与分组 采用覃颖等［6］母婴分离加醋酸灌肠联合结直肠扩张刺激法构建大鼠IBS模型：幼年大鼠出生后第2～21天每日进行3 h母子分离；幼年大鼠出生后第8～21天将经石蜡润滑后直径为1 mm 的中心静脉导管缓慢插入幼鼠肛门约2 mm处，0.5%醋酸灌肠，随着日龄增长灌注量逐渐增加，其中第8～10 天灌注0.2 ml，第11～12 天灌注0.3 ml，第13～15 天灌注0.4 ml，第16～17 天灌注0.5 ml，第18～19 天灌 注0.6 ml，第20～21 天灌 注0.7 ml；第22～24 天不进行任何干扰；当幼鼠发育至25 d 时，母子分笼正常饲养；幼鼠发育至42 d 时，给予1 次结直肠扩张刺激：将经石蜡润滑后的6F 导尿管插入大鼠肛门6～7 cm 处后固定，待大鼠适应后，均匀缓慢向导尿管中注入0.5 ml蒸馏水（0.5 ml/min）以扩张结直肠并维持30 s，使大鼠腹部抬起，为提高造模成功率和模型稳定性，实验重复3次，每次间隔5 min；将大鼠正常饲喂至8 周龄。根据其粪便和行为学进行筛选：当大鼠腹泻且精神状态与正常大鼠存在明显差异时，表明模型制备成功［7］。将造模成功大鼠随机分为模型组、舍曲林低、中、高剂量（10、20、30 mg/kg）组［8］、阳性对照组（匹维溴铵，2 mg/kg）［9］，每组15只，另取15只正常大鼠作为对照组。大鼠发育至9 周龄时开始灌胃给药，对照组和模型组给予等体积生理盐水，其他各组给予相应药物，2次/d，连续10 d，10 ml/kg。

1.2.2 各组大鼠一般情况、粪便含水量和排便时间 大鼠给药结束12 h 内，观察大鼠精神状态、饮食、行为活动等一般情况并记录，各组大鼠提尾，进行排便刺激，离心管采集大鼠粪便，称重记录，同时记录排便时间，大鼠粪便烘干后再次称重并记录，计算大鼠粪便含水率。

1.2.3 腹部撤回反射（abdominal withdrawal reflex，AWF）评分法检测大鼠内脏敏感性 对各组大鼠持续进行提尾刺激，使其排尽粪便后，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg/kg）轻度麻醉，将经石蜡润滑后带球囊且未充气的导管从大鼠肛门缓慢插入，使球囊末端距肛门约1 cm 处并固定于大鼠尾根部。每只大鼠给予球囊扩张3 次，扩张容量分别为1.0、1.5、2.0 ml，每次扩张持续30 s，重复3 次，根据AWF 评分标准（0 分：大鼠情绪基本稳定，未出现敏感现象；1 分：大鼠情绪变得不稳定，偶尔扭转头部；2 分：大鼠腹背部肌肉轻微收缩，但腹部未抬离地面；3 分：大鼠腹背部肌肉较强烈收缩，腹部抬离地面；4 分：大鼠腹背部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形，腹部和会阴部均抬离地面）取平均值并进行统计分析，分值越高表明大鼠内脏敏感性越强。

1.2.4 HE 染色观察各组大鼠结肠组织病理学变化 1.2.2和1.2.3实验结束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）深度麻醉后处死大鼠，分离大鼠结肠组织，每组取5只大鼠结肠组织（其余大鼠结肠组织迅速置于-80℃冰箱用于ELISA 和Western blot检测），4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，为使组织切片与载玻片贴合更紧密，需在60℃下烤片2 h，依次切片，脱蜡入水，染色，30℃烘干30 min，中性树胶封固，光学显微镜下观察并拍照。

1.2.5 ELISA 检测各组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP 含量取1.2.4中置于-80℃冰箱中的大鼠结肠组织，每组0.05 g，低温融化，加入9 倍体积预冷后的PBS 匀浆，13 000 r/min 离 心15 min，取上清，按照IL-1β、TNF-α、IL-6 和cAMP ELISA试剂盒说明书操作，每组设3个重复。

1.2.6 Western blot 检测各组大鼠结肠组织cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白表达 取1.2.4 中置于-80℃冰箱中的各组大鼠剩余结肠组织，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒定量，SDS-PAGE 电泳，转膜，抗体封闭，加入1∶2 000 稀释后的cAMP、PKA、CREB 和p-CREB 鼠抗4℃孵育过夜，含辣根过氧化物酶缀合的二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，ECL 显色，凝胶成像仪拍照，以β-actin 为参照，分析灰度值，得到蛋白表达，每组设3个重复。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 舍曲林对IBS 大鼠一般情况、排便时间和粪便含水量的影响 对照组大鼠精神状态良好，发育正常，皮毛光亮。与对照组相比，模型组大鼠精神状态较差，情绪烦躁易怒，活动较少，排便时间显著缩短（P＜0.05），粪便含水量显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，舍曲林低、中、高剂量组大鼠异常状态逐渐改善，排便时间依次延长（P＜0.05），粪便含水量依次降低（P＜0.05）；舍曲林高剂量组与阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 各组大鼠排便时间及粪便含水率比较（，n=15）Tab.1 Comparison of defecation time and fecal water content of rats in each group（，n=15）

表1 各组大鼠排便时间及粪便含水率比较（，n=15）Tab.1 Comparison of defecation time and fecal water content of rats in each group（，n=15）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.2 舍曲林对IBS大鼠内脏敏感性的影响 如表2所示，与对照组相比，模型组大鼠内脏敏感性显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，舍曲林低、中、高剂量组大鼠内脏敏感性依次降低（P＜0.05）；舍曲林高剂量组与阳性对照组大鼠内脏敏感性差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠内脏敏感性比较（，n=15，分）Tab.2 Comparison of visceral sensitivity of rats in each group（，n=15，score）

表2 各组大鼠内脏敏感性比较（，n=15，分）Tab.2 Comparison of visceral sensitivity of rats in each group（，n=15，score）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.3 舍曲林对IBS 大鼠结肠组织病理学变化的影响 对照组大鼠结肠组织肠黏膜屏障结构完整，无炎症因子浸润；模型组大鼠结肠组织出现明显水肿，肠黏膜完整性受损，出现大量炎症细胞浸润；舍曲林低、中、高剂量组大鼠结肠组织水肿逐渐消除，肠黏膜趋于完整，炎症细胞浸润逐渐减少；舍曲林高剂量组与阳性对照组大鼠结肠组织病理学变化无显著差异（图1）。

图1 各组大鼠结肠组织病理学HE染色（×200）Fig.1 HE staining of colon tissue pathology of rats in each group（×200）

2.4 舍曲林对IBS 大鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP 含量的影响 如表3 所示，与对照组相比，模型组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量显著升高，cAMP 含量显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，舍曲林低、中、高剂量组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量依次降低，cAMP 含量依次升高（P＜0.05）；舍曲林高剂量组与阳性对照组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP 含量差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP含量比较（，n=15）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 and cAMP levels in colonic tissue of rats in each group（，n=15）

表3 各组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP含量比较（，n=15）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 and cAMP levels in colonic tissue of rats in each group（，n=15）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.5 舍曲林对IBS 大鼠结肠组织cAMP、PKA 蛋白表达及CREB 磷酸化水平的影响 与对照组相比，模型组大鼠结肠组织cAMP、PKA 蛋白表达及CREB 磷酸化水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，舍曲林低、中、高剂量组大鼠结肠组织cAMP、PKA 蛋白表达及CREB 磷酸化水平依次升高（P＜0.05）；舍曲林高剂量组与阳性对照组大鼠结肠组织cAMP、PKA 蛋白表达及CREB 磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05，图2、表4）。

图2 各组大鼠cAMP、PKA和CREB蛋白表达Fig.2 cAMP，PKA and CREB protein expressions of rats in each group

表4 各组大鼠结肠组织中cAMP、PKA 蛋白表达及CREB磷酸化水平比较（，n=10）Tab.4 Comparison of cAMP，PKA protein expressions and CREB phosphorylation level in colon tissue of rats in each group（，n=10）

表4 各组大鼠结肠组织中cAMP、PKA 蛋白表达及CREB磷酸化水平比较（，n=10）Tab.4 Comparison of cAMP，PKA protein expressions and CREB phosphorylation level in colon tissue of rats in each group（，n=10）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

3 讨论

随着社会经济发展和人们生活习惯改变，IBS发病率不断上升，但其产生的病因尚不明确，由于IBS 并发抑郁和焦虑的风险较高，因此，精神心理异常和肠道刺激因素可能是产生IBS 的主要因素，其中心理应激与IBS 发生和复发密切相关［10］。IBS 发病机制可能由于细胞内氧化应激产生，进而降低结肠收缩性，从而导致结肠损伤［11］。本研究采用母婴分离加醋酸灌肠联合结直肠扩张刺激法制备大鼠IBS 模型，结果发现，模型组大鼠精神状态较差，情绪烦躁易怒，活动较少，结肠组织出现明显水肿，结肠黏膜完整性受损，出现大量炎症细胞浸润，排便时间和结肠组织中cAMP 含量显著降低（P＜0.05），粪便含水量、内脏敏感性、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量显著升高（P＜0.05），提示IBS大鼠模型构建成功，且产生结肠组织炎症反应。

舍曲林主要用于治疗抑郁症相关疾病，包括焦虑症、狂躁症等，且能有效防止症状复发，具有较高的安全性和耐受性。随着对其药理作用的不断研究，发现给予溃疡性结肠炎伴抑郁患者盐酸舍曲林联合美沙拉秦治疗后，可有效缓解患者抑郁症状，且能改善溃疡性结肠炎［12］。焦虑患者经舍曲林治疗后，其促炎细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8 含量显著下降［13-14］。本研究发现，经舍曲林干预后，IBS 大鼠不良症状逐渐缓解，排便时间、cAMP 含量显著升高（P＜0.05），粪便含水量、内脏敏感性、TNF-α、IL-1β和IL-6 含量显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性，提示舍曲林可能通过减轻结肠组织炎症反应缓解大鼠IBS，但其机制尚需进一步研究。

cAMP/PKA 信号通路可介导细胞外信号与相应受体结合，调控第二信使cAMP 水平，引发下游事件，主要过程是通过活化cAMP 依赖的PKA 导致下游靶蛋白磷酸化，从而影响细胞代谢和行为，使细胞快速应答胞外信号。王莹等［15］研究发现，大鼠胃肠组织基于cAMP/PKA 信号转导通路的变化与大鼠脾气虚证模型显著相关。YU 等［16］研究发现，白藜芦醇可通过激活肠-脑轴中5-羟色胺依赖的PKA/CREB 信号，改善IBS引起的抑郁、焦虑、内脏超敏和肠道运动异常等症状。LI 等［17］研究发现，利拉鲁肽通过上调cAMP/PKA 信号通路调节星形细胞极化，减轻炎症反应，进而保护非酒精性脂肪肝。结直肠癌中，激活cAMP/PKA 通路可抑制肿瘤血管生成和血管生成拟态［18］。磷酸二酯酶抑制剂可通过cAMP/PKA/CREB 信号转导和抗炎作用逆转转基因小鼠学习和记忆缺陷［19］。另外，木犀草素可能通过PKA 改善IBS［20］。而PKA 蛋白激酶信号通路参与应激反应诱导的内脏敏感性［21］。本研究发现舍曲林可显著提高大鼠结肠组织cAMP、PKA 蛋白表达及CREB 磷酸化水平，提示舍曲林可能通过上调cAMP/PKA 通路减轻大鼠肠道炎症反应，进而延缓大鼠IBS发展。

综上所述，舍曲林可能通过剂量依赖性上调cAMP/PKA 通路减轻大鼠肠道炎症反应，进而延缓IBS 发展，为临床舍曲林治疗IBS 提供了依据，但舍曲林对IBS的作用机制十分复杂，尚需深入研究。