小胶质细胞介导的TRPV1 在小鼠缺血性脑卒中后抑郁样行为中的作用和机制①

刘 丹 方天赐 李明玥 宋远见 王玉兰（徐州医科大学人体解剖学教研室，徐州 221000）

缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是指由于各种突发原因引起的大脑局部血供障碍，造成组织缺血性坏死，导致相应的阶段性或永久性的神经功能损伤的一种疾病。近年来，IS 的发病率逐年增加，其高致死率和高致残率已经成为全球主要的公共卫生问题［1］。脑缺血发生后，小胶质细胞被迅速激活，分泌各种蛋白水解酶和炎症因子，如IL-1β，从而导致脑损伤［2］。临床研究表明，约有31%的IS 患者经历临床抑郁症［3］。脑血管疾病和抑郁症的机制是相互交错的［4］。抑郁症患者具有更高水平的炎症标志物和激活的小胶质细胞，因此小胶质细胞引起的神经炎症可能是造成抑郁症的原因之一，对于抗炎药物的使用在一定程度上可缓解抑郁症状［5］。

辣椒素受体1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是TRP 通道家族中最具特征的成员之一，可被多种物理或化学刺激激活。TRPV1 在啮齿动物脑中广泛表达，包括海马、皮质和杏仁核［6］。TRPV1 可通过调节神经胶质细胞的活性来介导神经炎症，在受到刺激后TRPV1 被激活，改变小胶质细胞的形态和功能，从而清除细胞碎片，但如果没有有效的限制，可能会导致神经元功能失调并诱发持续性炎症［7］。和周围神经系统相比，TRPV1 在中枢神经系统中的作用仍知之甚少［6］。部分研究表明，TRPV1 在缺血性脑损伤中起重要作用，可能是一个潜在靶标［8］。然而TRPV1 对IS 后抑郁的作用尚不清楚，因此本研究旨在探讨TRPV1对IS后抑郁样行为的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6周龄雄性C57BL/6J小鼠45只，体质量22～24 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SCXK（鲁）20190003。所有动物均在12 h 光照/12 h 黑暗循环下饲养，温度控制在23℃左右，湿度保持在60%～65%。

1.1.2 主要试剂 Capsazepine（Sigma 公司）；Iba1抗体（Wako公司/Santa cruz公司）；TRPV1抗体（Novus公司）；Goat Anti-Rabbit IgG H&L、Goat Anti-Mouse IgG H&L（Abcam公司）；DAPI染色试剂、苏木素伊红（HE）染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司），IL-1β抗体、β-actin抗体（Proteintech公司）。

1.2 方法

1.2.1 大脑中动脉阻塞（MCAO）模型 采用改良的线栓法构建MCAO 模型：异氟烷持续麻醉小鼠后仰卧位固定。沿颈正中线切开皮肤，充分暴露并分离右侧的颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈总动脉和颈外动脉，于颈外动脉结扎处以上插入线栓并通过颈内动脉最终进入大脑中动脉，固定线栓。缺血1 h 后，缓慢退出线栓，恢复大脑血供，缝合并消毒伤口。Sham 组制备前期步骤同上，但不插入线栓。

1.2.2 分组与给药 将小鼠随机分为3组：假手术组（sham），脑缺血再灌注组（ischemia/reperfusion，I/R），脑缺血再灌注+TRPV1 抑制剂capsazepine 组（I/R+CPZ），15只/组。

将小鼠固定于脑立体定位仪上，以前囟为零点在前囟后0.7 mm、右侧1.0 mm 和深2.5 mm 处插入微量注射泵，于5 min内缓慢匀速给药。Capsazepine溶于2%DMSO+10%Tween80 生理盐水，每只小鼠的剂量为7.5µg/3µl。

1.2.3 强迫游泳实验 将小鼠放入透明玻璃圆筒中（12 cm×25 cm），筒内水深约15 cm，水温为25℃。累计5 min 内小鼠的不动时间，当小鼠停止挣扎，漂浮在水中不动，或做一些轻微动作保持头部浮在水面上的时间视为不动时间［9］。

1.2.4 悬尾实验 用绳和胶带将小鼠倒挂于挂钩上，头朝下距地面约5 cm，累计记录5 min 内小鼠放弃挣扎静止不动的时间［10］。

1.2.5 免疫荧光染色 取出脑组织冰冻切片，室温下复温30 min，PBS清洗5 min×3次，BSA室温封闭2 h，滴加一抗Iba1（1∶1 000）、TRPV1（1∶400），4℃孵育过夜，PBS清洗5 min×3次，避光加入羊抗兔及羊抗鼠二抗（1∶600），室温2 h，PBS 清洗5 min×3 次后加入DAPI 染色试剂，室温5 min，PBS 清洗5 min×3 次，防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察并摄片。

1.2.6 HE 染色 取出脑片室温下复温30 min，PBS 清洗2 min，苏木素染液浸泡8 min，自来水冲洗5 min，伊红染液浸泡15 s，自来水冲洗5 min，梯度乙醇脱色，二甲苯透明5 min，中性树胶封片，显微镜观察并摄片。

1.2.7 免疫印迹 提取各组小鼠脑半暗带组织，BCA 法检测蛋白浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳，湿转30 min，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗兔抗IL-1β（1∶800），4℃孵育过夜。1×TBST 清洗后加入兔二抗（1∶10 000），室温避光孵育2 h，采用Odissey 远红外显像系统对各组条带结果进行扫描。使用Image J软件对条带进行蛋白定量分析，各组蛋白定量以目的蛋白灰度值与内参（β-actin）灰度值比值进行统计学分析，实验重复3次，取均值。

1.3 统计学处理 使用SPSS19.0软件进行统计分析，数据以表示，所有实验数据均采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），以α=0.05 为检验标准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制TRPV1 对脑卒中后小鼠抑郁样行为的影响 强迫游泳实验结果和悬尾实验结果显示：与sham 组相比，I/R 组小鼠强迫游泳静止时间及悬尾静止时间明显延长（P＜0.001）。而在侧脑室给予TRPV1 抑制剂capsazepine 后，在强迫游泳和悬尾实验中，与I/R 组相比，I/R+CPZ 组的静止时间显著缩短（P＜0.001）。表明抑制TRPV1对小鼠脑卒中后的抑郁样行为有明显改善（表1）。

表1 强迫游泳和悬尾实验小鼠的不动时间（）Tab.1 Immobility time of mice in forced swimming and tail suspension experiments（）

表1 强迫游泳和悬尾实验小鼠的不动时间（）Tab.1 Immobility time of mice in forced swimming and tail suspension experiments（）

Note：I/R vs sham，1）P＜0.001；I/R+CPZ vs I/R，2）P＜0.001.

2.2 抑制TRPV1 对脑卒中后小鼠杏仁核区病理影响 HE染色结果显示：I/R组可见细胞数量减少，排列疏松散乱，周围出现水肿间隙部分细胞核固缩深染，而CPZ 处理之后，I/R+CPZ 组细胞形态基本恢复（图1）。

图1 Capsazepine对杏仁核区病理影响（20 μm）Fig.1 Effect of Capsazepine on pathology of amygdala（20 μm）

2.3 TRPV1 在杏仁核小胶质细胞中的表达 免疫荧光观察结果显示：TRPV1 和小胶质细胞间存在明显的空间共定位，表明小胶质细胞中有TRPV1 的表达（图2）。

图2 TRPV1在小胶质细胞中的表达（20 μm）Fig.2 TRPV1 expression in microglia（20 μm）

2.4 抑制TRPV1 对脑卒中后杏仁核小胶质细胞激活的影响 免疫荧光观察结果显示：与sham 组（5.667±1.155）相比，I/R 组（22.670±2.309）杏仁核小胶质细胞标志物Iba-1 的阳性个数明显增加（P＜0.001），突起减少，胞体增大，呈现出显著的激活状态；而经过CPZ（10.330±1.528）处理之后，小胶质细胞激活数量明显减少（P＜0.001，图3）。

图3 Capsazepine对小胶质细胞激活的影响（20 μm）Fig.3 Effect of Capsazepine on microglial activation（20 μm）

2.5 抑制TRPV1 对IL-1β 表达的影响 免疫印迹检测结果显示：I/R 组小鼠脑部炎症因子IL-1β 的蛋白表达量（3.022±0.237 4）相较sham 组（1.988±0.159 2）明显上升（P＜0.01），而在TRPV1 被抑制后，I/R+CPZ 组（2.341±0.287 2）IL-1β 表达量明显下降（P＜0.05，图4）。

图4 Capsazepine对IL-1β表达的影响Fig.4 Effect of Capsazepine on IL-1β expression

3 讨论

TRPV1 与多个器官或系统中的免疫过程和炎症通路密切相关［11］。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻髓样细胞，其活性同样受到TRPV1 的调节。在外周，TRPV1 调节免疫细胞迁移进入脑实质，从而促进炎症反应。研究表明，TRPV1通过增强IL-1β和IL-6 的作用，在神经系统疾病中发挥促炎作用［12］。本实验主要研究抑制TRPV1 后是否能减少炎症反应并进一步改善小鼠的抑郁样行为。结果发现，侧脑室注射TRPV1 抑制剂Capsazepine 后，小鼠的强迫游泳和悬尾不动时间明显减少，表明其抑郁样行为有一定程度的改善。此外，研究还发现TRPV1 在小胶质细胞中存在表达，且Capsazepine 能减少杏仁核区域病理性损伤和小胶质细胞的激活以及IL-1β 的表达，证明抑制TRPV1 能减轻IS 后的炎症反应。

多项研究表明，炎症和抑郁有相关性，中风后抑郁的患者早期即出现炎症标志物，促炎细胞因子及促炎/抗炎比率的增加和补体表达的降低［13］。KREISEL 等［14］发现抗抑郁药亚胺丙嗪能够缓解应激诱导的小胶质细胞的数量及形态变化，减轻抑郁样行为，表明小胶质细胞也与抑郁症的发生发展有关。最近的数据同样表明中风后抑郁涉及炎症、氧化应激和免疫机制［15］。本研究结果也进一步说明了抑制TRPV1 可能是通过对IS 后炎症的改善来对小鼠的抑郁样行为起到保护作用。前期研究大多表明炎症在中风后抑郁中的作用，但ORMSTAD等［16］的数据表明，在卒中后的6、12 和18 个月炎症相关因子和抑郁之间并不存在关联，这可能是由于样本量较少，而测量的炎症因子数量过多所致。

综上所述，本研究显示，抑制TRPV1 可能通过影响小胶质细胞进而减轻炎症反应，从而改善IS 后的抑郁样行为。因此TRPV1 在卒中后抑郁的治疗中可能是一个关键性靶点。