JAK/STAT 信号通路在小鼠心肌梗死发病中的作用及对NF-κB、TNF-α表达的影响①

卢世文 余丽菲（广西医科大学第二附属医院心血管内科，南宁 530007）

心肌梗死是由冠状动脉急性、持续性供血、供氧不足而导致的心肌组织细胞坏死症状，具有发病率高、病死率高、病情进展快和预后差的特点，主要临床表现为胸骨后剧烈持久疼痛，可能会并发心律失常［1-2］。据世卫组织统计数据显示，老年人为心肌梗死高发群体，近年来我国人口老龄化现象愈发严重，心肌梗死新增病例逐年上升，但是心肌梗死发病机制尚未研究透彻［3］。JAK/STAT 信号通路是重要的细胞因子信号传导途径，能够将细胞膜感受到的刺激信号向细胞核传递，对机体炎症反应等产生影响［4］。XIN 等［5］研究表示，JAK/STAT 信号通路在心肌梗死中起重要作用，靶向调控JAK/STAT 信号通路，能够有效抑制心肌梗死后心肌组织细胞凋亡。本研究建立心肌梗死小鼠模型，并靶向调控JAK/STAT信号通路，观察其效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取30 只SD 健康雄性小鼠，由吉林大学动物实验中心提供，5～7 周龄，平均（6.0±0.8）周龄；体质量20～28 g，平均体质量（24.1±3.2）g。在相对湿度50%～55%、温度（24.1±2.1）℃的环境中喂养小鼠1周，光照12 h/d。本研究获广西医科大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂 兔抗大鼠JAK1、JAK2 抗体（Hyclone 公 司）；兔抗小鼠STAT3、STAT5 抗体（Invitrogen 公司）；大鼠抗小鼠NF-κB 抗体（Gibco公司）；小鼠抗大鼠TNF-α抗体（BD公司）；酶联免疫试剂盒（北京维德维康生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组 随机选取10 只小鼠为正常组，不做干预。其余20 只小鼠建立心肌梗死模型：麻醉干预后对小鼠背部进行消毒，固定后将喉管切开，连接呼吸机，使用剪刀将左侧第3、4段肋间皮肤剪开，打开小鼠胸腔，使小鼠心脏组织暴露于术野之中。剪开心包膜后对冠状动脉前支进行穿线结扎，之后清创缝合。所有小鼠进行心电图检查，ST段上抬至弓背向上为建模成功。建模成功18只，随机分为心肌梗死组、阻断干预组各9 只。阻断干预组小鼠使用5 mg/kg AG490 溶液灌胃，正常组、心肌梗死组小鼠使用等量生理盐水进行灌胃。所有小鼠均干预4周。

1.2.2 心功能指标检测 对小鼠麻醉处理后，左倾30°仰卧固定，剃毛后将超声探头置于左胸骨，与中线夹角20°，观察记录各组小鼠舒张末期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall diastolic dimension，LVPWDd）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）、舒张末期室间隔厚度（left ventricular end-systolic diameter，LVESd）水平。

1.2.3 心脏、左心室重量指数检测 对所有小鼠体质量进行统计，之后对3组小鼠进行全麻处理，采用断头法处死，将小鼠心脏组织取出，并将心腔内残留血液清除，称取小鼠心脏、左心室重量，计算心脏、左心室重量指数。

1.2.4 HE染色处理 取小鼠心脏，固定在4%甲醛中完全浸泡，24 h 后行常规石蜡包埋及连续切片。首先将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置于不同浓度的乙醇中各复脱水3 min。使用苏木精染色15 min 后清洗3 次，盐酸乙醇分化处理30 s，充分清洗之后使用1%伊红染色，乙醇脱水处理后进行脱蜡，封片后使用显微镜进行观察。

1.2.5 Western blot 检测JAK/STAT 通路蛋白表达 取RIPA 裂解液，1.5℃PMSF 冰中孵育30 min，1 500 r/min离心15 min，取上清。每个样品取15 g 蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转入PVDF 膜，5%脱脂牛奶常温下密封2 h。加入抗体过夜。取出后TBST液冲洗，加入二抗，60 min 后清洗、显色，对JAK/STAT通路蛋白相对表达量进行检测。

1.2.6 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡情况 常温下使用20µg/ml蛋白酶K培养0.5 h后去除蛋白，清洗后加入100 µl 平衡缓冲液，室内平衡10 min，滴入100 µl TdT 酶反应液，避光、室温环境中孵育1 h 后加入100µl SSC 溶液，静置20 min后清洗3次，DAPI复染，避光培养10 min 后清洗、封片观察。DAPI 复染细胞核呈蓝色，凋亡细胞细胞核呈绿色，每切片取3个视野进行观察、计算细胞凋亡率和平均值。

1.2.7 ELISA 检测NF-κB、TNF-α 水平 标记酶标板，制作标准品，然后取出试剂盒，以1∶2 的稀释液稀释样品；在反应孔上100µl/孔依次加入稀释好的待测血清和标准品，放置37℃恒温孵育箱中湿育2 h；用专用的洗涤液将反应板清洗3 次，加入抗体工作液（1∶100 稀释）100 µl/孔，放于37℃恒温孵育箱中湿育45 min；继续清洗反应板4 次，在反应孔内加入TMB 溶液100 µl/孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min，在反应孔内加入终止液100µl/孔终止反应，450 nm 波长测定吸光度，反应颜色深浅与NF-κB、TNF-α水平成正比，经标准曲线计算NF-κB、TNF-α水平。

1.3 统计学处理 使用SPSS21.0软件进行统计分析，计量资料以描述，多组对比行F值检验，组间对比行独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组小鼠心脏组织切片、心肌梗死区周边区域HE 染色图 如图1所示，正常组小鼠无心肌梗死状况，心肌梗死组小鼠心肌梗死面积较大，与心肌梗死组相比，阻断干预组小鼠心肌梗死面积明显缩小。如图2所示，正常组小鼠心肌组织细胞清晰，心肌组织细胞排列规则紧密；心肌梗死组小鼠心肌组织细胞排列杂乱，出现较多胶原纤维，心肌横纹破坏严重，伴有炎症细胞浸润；阻断干预组小鼠心肌组织细胞形态较为完整，排列较为规则，炎症细胞浸润情况明显减轻。

图2 3组小鼠心肌梗死区周边区域HE染色（×400）Fig.2 HE staining of periphery of myocardial infarction in three groups of mice（×400）

2.2 3组小鼠各项心功能指标水平比较 如表1所示，正常组小鼠心功能指标均低于其他两组，且与心肌梗死组比较，阻断干预组LVPWDd、IVSDd、LVEDd、LVESd水平较低，差异具有统计学（P＜0.05）。

表1 3组小鼠心功能水平比较（）Tab.1 Comparison of cardiac function levels among three groups of mice（）

表1 3组小鼠心功能水平比较（）Tab.1 Comparison of cardiac function levels among three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

2.3 3 组小鼠心脏、左心室重量指数比较 如表2所示，正常组小鼠心脏、左心室重量及心脏、左心室重量指数均低于心肌梗死组和阻断干预组，且阻断干预组小鼠心脏、左心室重量及心脏、左心室重量指数均低于心肌梗死组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 3组小鼠心脏、左心室重量指数比较（）Tab.2 Comparison of heart and left ventricular weight index in three groups of mice（）

表2 3组小鼠心脏、左心室重量指数比较（）Tab.2 Comparison of heart and left ventricular weight index in three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

2.4 3 组小鼠JAK/STAT 信号通路相关蛋白表达比较 如表3、图3 所示，正常组小鼠JAK1、JAK2、STAT3、STAT5 蛋白相对表达量均低于心肌梗死组和阻断干预组，阻断干预组小鼠JAK1、JAK2、STAT3、STAT5 蛋白表达均低于心肌梗死组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 3组小鼠JAK/STAT信号通路相关蛋白表达对比（）Tab.3 Comparison of JAK/STAT signaling pathway-related protein expression in three groups of mice（）

表3 3组小鼠JAK/STAT信号通路相关蛋白表达对比（）Tab.3 Comparison of JAK/STAT signaling pathway-related protein expression in three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

图3 JAK/STAT信号通路相关蛋白表达Fig.3 JAK/STAT signaling pathway-related proteins expressions

2.5 3 组小鼠心肌细胞凋亡情况比较 如表4 所示，心肌梗死组小鼠各时间点心肌细胞凋亡率均高于正常组，阻断干预组小鼠各时间点心肌细胞凋亡率均低于心肌梗死组，高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 3组小鼠心肌细胞凋亡情况对比（xˉ±s，%）Tab.4 Comparison of cardiomyocyte apoptosis in three groups of mice（xˉ±s，%）

2.6 3 组小鼠心肌组织NF-κB、TNF-α 表达水平比较 如表5所示，正常组小鼠心肌组织NF-κB、TNF-α表达水平均低于心肌梗死组和阻断干预组，阻断干预组小鼠心肌组织NF-κB、TNF-α 表达水平均低于心肌梗死组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表5 3组小鼠心肌组织NF-κB、TNF-α表达水平比较（）Tab.5 Comparison of expression levels of NF-κB and TNF-α in myocardial tissue of three groups of mice（）

表5 3组小鼠心肌组织NF-κB、TNF-α表达水平比较（）Tab.5 Comparison of expression levels of NF-κB and TNF-α in myocardial tissue of three groups of mice（）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with myocardial infarction group，2）P＜0.05.

3 讨论

大量临床研究表明，心肌梗死症状的发生发展伴随心功能异常及心室重构［6-7］。LVPWDd、IVSDd、LVEDd、LVESd 是常用的评价心功能的指标［8］。本研究显示，心肌梗死模型小鼠心功能出现明显异常，心脏、左心室重量指数较大，上述结果提示心肌梗死小鼠模型制备成功，与临床心肌梗死病变的基本特征一致。心肌梗死发生后，心肌细胞迅速凋亡坏死，刺激NF-κB 活化并快速从细胞浆转移至细胞核内，与特异的κB位点结合，启动如TNF-α等多种活性细胞因子释放，增高的TNF-α 通过第二信使途径反馈性地刺激NF-κB，在梗死区爆发炎症反应，加重缺血心肌部位的损伤［9-15］。如本研究结果所示，HE 显示心肌梗死组小鼠心肌组织细胞排列杂乱，出现较多胶原纤维，心肌横纹破坏严重，伴有炎症细胞浸润，心肌梗死组小鼠心肌细胞凋亡率高于正常组，心肌组织NF-κB、TNF-α表达水平低于正常组小鼠。

近年研究表明，作为细胞内的信号传导通路JAK/STAT能够对机体炎症反应、细胞凋亡等进行调控。激活的JAK 可将受体特定的络氨酸残基磷酸化，成为STAT 与细胞内其他信号分子的结合位点，并将集合在该位点的STAT 磷酸化激活，活化的STAT与受体形成聚合体并进入到细胞核，启动对应的基因转录。有学者认为JAK/STAT 信号通路参与血管生成、心血管疾病的发生发展［16］。EID 等［17］在研究中指出JAK/STAT 信号通路参与心肌梗死后心室重构，上调心肌梗死后的损伤因子表达，上调的损伤因子又可提高JAK/STAT信号通路活性，靶向阻断JAK/STAT 信号通路能够起到心肌保护作用。如本研究结果显示，心肌梗死小鼠心肌的JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白相对表达量明显增高，提示JAK/STAT信号通路参与心肌梗死病变过程，与上述文献一致。如进一步使用JAK/STAT 信号通路特异性阻断剂AG490 进行干预，心肌梗死小鼠心功能指标水平出现下降，心脏、左心室重量指数出现下降，提示对JAK/STAT信号通路进行阻断后，心肌梗死小鼠心功能、左室重构、心肌炎症细胞浸润等病变均得到明显改善。同时特异性阻断剂AG490干预可显著降低心肌梗死模型小鼠心肌组织细胞凋亡率、心肌NF-κB与TNF-α 表达、心肌JAK1、JAK2、STAT3、STAT5 蛋白表达，上述结果证实心肌梗死的炎症反应依赖于JAK/STAT 信号通路活性，阻断JAK/STAT 信号通路能够缓解心肌梗死小鼠心肌组织炎症反应，进而缓解心室重构，改善心肌梗死症状，其可能原因在于TNF-α mRNA 启动子含有STAT 结合位点，AG490干预降低STAT 活化或活性，进而降低TNF-α 转录，进一步降低NF-κB激活［14，18-20］。

综上所述，小鼠心肌梗死发病后心功能及心脏、左心室重量指数出现异常，使用AG490 阻断JAK/STAT信号通路后，小鼠心功能及心肌细胞凋亡情况得到改善，心脏、左心室重量指数下降，心肌组织炎症反应得到抑制。JAK/STAT 信号通路在心肌梗死的炎症反应、心室重构等方面起关键作用，抑制JAK/STAT 信号通路活性可能是心肌梗死治疗的潜在靶点。