急性热应激对睾丸免疫微环境相关蛋白的影响①

胡素芹 胡 珂 刘殿龙 李春蕊 许亚辉 崔力丹 郭 健（北京中医药大学中医学院，北京 102488）

近年来，男性生殖健康一直被广泛关注。研究证实，环境因素显著影响精子数量和质量，严重阻碍男性生殖功能［1-2］。阴囊温度时常会受到自身坐势、穿着、生活方式、职业等外部因素的影响［3］。在众多环境影响因素中，尽管睾丸热应激被证明是男性生育能力降低的主要危害之一，但却最易被忽略［4-5］。此外，随着全球气候变暖，有害物质的不利影响将逐渐恶化［6］。

睾丸是典型的免疫豁免组织，具有特殊的免疫调节机制，该机制在精子发生过程中发挥重要作用。免疫豁免和免疫防御两方面协调存在，共同维持了正常的睾丸免疫微环境平衡［7］。当这种免疫微环境稳态失衡时，睾丸就会发生炎症并损害精子发生过程，影响男性生殖功能。血睾屏障由睾丸支持细胞通过细胞间紧密连接、缝隙连接和锚定连接构成，是执行免疫豁免功能的天然物理屏障，其严格限制分子和细胞通过，阻止病原微生物或抗原的侵袭，同时可阻止循环中的抗体进入生殖道管腔，避免因免疫应答或炎症反应造成局部损伤，为精子发生提供了适宜的免疫微环境［8-9］。血睾屏障的破坏可导致免疫豁免功能的破坏，进而诱发机体自身免疫应答，导致不育［10］。而高温对睾丸内免疫微环境的影响尚不清楚。本实验旨在观察急性热应激后不同时间睾丸内血睾屏障相关分子及经典炎症通路NF-κB 信号通路的变化，进而探讨热应激对睾丸免疫微环境的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级成年雄性SD 大鼠49 只，8 周龄，体质量310～340 g，购自北京斯贝福实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。大鼠饲养环境温度控制在22～25℃，相对湿度40%～70%，昼夜节律每12 h 交替，自由饮水和进食，所有大鼠均适应性喂养1周后进入本实验。

1.1.2 主要试剂 生理盐水（石家庄四药有限公司）；甲醇（北京化工厂）；中性裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白磷酸酶抑制剂（北京索莱宝科技有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒、30%丙烯酰胺、10×TBST、山羊抗兔IgG（H+L）Biotin-conjugated、过氧化物酶标记链酶亲和素（康为世纪生物科技有限公司）；TEMED（BioRule 公司）；Page Ruler Prestained Protein Ladder（Thermo Scientific 公司）；PVDF 膜（美国millipore 公司）；兔抗大鼠Vimentin、NF-κB p65、phospho-NF-κB p65、IκBα、phospho-IκBα单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；兔抗大鼠occludin、β-actin 多克隆抗体（美国Proteintech 公司）；兔抗大鼠ZO-1 单克隆抗体（美国赛默飞invitrogin 公司）；IL-1β ELISA 试剂盒（美国Raybiotech公司）。

1.1.3 主要仪器 SSW-420-2S 恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；VCX150 超声破碎仪（美国SONICS 公司）；Mini Trans-Blot cell 电泳槽、ChemiDoc MP 凝胶成像系统、iMark 酶标仪（美国Bio-Rad公司）；DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 SD 大鼠按照体质量随机分为7组，即1个对照组和6个热应激组（0.5 h组、2 h组、4 h 组、6 h 组、24 h 组和48 h 组），7 只/组。适应性喂养1 周后，除对照组以外，其余6 组大鼠用2%戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉后，43℃恒温水浴20 min，并分别于水浴结束后0.5 h、2 h、4 h、6 h、24 h 和48 h的6个时间点摘取睾丸，-80℃冰箱冻存。

1.2.2 Western blot 检测大鼠睾丸内蛋白表达变化 睾丸组织加入适量PMSF、磷酸酶抑制剂和中性裂解液并研磨破碎，以12 000 r/min 低温离心5 min，收集上清液。BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度后，100℃煮沸5 min 进行蛋白变性。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF 膜（孔径0.45 µm）。PVDF 膜用5%BCA 封闭液室温封闭1.5 h，而后用1%BCA 稀释的一抗孵育，4℃过夜。第2 天PVDF 膜室温摇床0.5 h，TBST 清洗4 次，5 min/次。PVDF 膜放入山羊抗兔IgG（H+L）Biotin conjugated 溶液（TBST 稀释，1∶1 000），37℃孵育1.5 h。TBST 洗膜5 min×4 次，过氧化物酶标记链酶亲和素溶液（TBST 稀释，1∶1 000）37℃孵育0.5 h。TBST 洗膜5 min×4 次后，PVDF 膜上加ECL 发光液反应1～3 min，然后置于凝胶成像系统中检测，所得图片使用Image J软件分析，检测各条带的灰度值。

1.2.3 ELISA法检测大鼠睾丸内IL-1β表达 采用ELISA法检测睾丸组织内IL-1β的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。微孔板用酶标仪检测每孔OD 值，450 nm 为检测波长，630 nm 为参考波长。所得OD 值用ELISA Cal 软件绘制标准曲线，计算各组IL-1β浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据分析，计量资料以表示。方差齐，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way-ANOVA），两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性热应激下调睾丸内波形蛋白vimentin 及血睾屏障紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1表达与对照组相比，6个热应激组大鼠睾丸内vimentin和occludin 的表达均显著降低（P＜0.01）；除0.5 h 组外，其余热应激组ZO-1表达相较于对照组均显著降低（P＜0.01），如图1。

图1 各组大鼠睾丸内vimentin、occludin和ZO-1表达Fig.1 Expressions of vimentin，occludin and ZO-1 in testis of rats in each group

2.2 急性热应激上调睾丸内NF-κB 信号通路关键分子的表达 与对照组相比，0.5 h 组、2 h 组和4 h组p-NF-κB p65 及p-IκBα 表达变化差异无统计学意义（P＞0.05），6 h 组、24 h 组和48 h 组p-NF-κB p65及p-IκBα的表达均显著增加（P＜0.01），如图2。

图2 各组大鼠睾丸内p-NF-κB p65和p-IκBα表达Fig.2 Expressions of p-NF-κB p65 and p-IκBα in testis of rats in each group

2.3 急性热应激后睾丸内IL-1β 的表达 与对照组相比，24 h 和48 h 热应激组大鼠睾丸内IL-1β 表达的差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图3。

表1 各组大鼠睾丸组织内IL-1β的表达（，n=6）Tab.1 Expression of IL-1β in testis of rats in each group（，n=6）

表1 各组大鼠睾丸组织内IL-1β的表达（，n=6）Tab.1 Expression of IL-1β in testis of rats in each group（，n=6）

图3 大鼠睾丸内IL-1β的表达变化Fig.3 Expression change of IL-1β in testis of rats

3 讨论

精子发生是一个复杂的过程，会产生抗原性蛋白却并未诱发免疫炎症反应，这有赖于睾丸特殊的免疫微环境和免疫调节功能［11］。血睾屏障作为天然物理屏障，在睾丸的免疫豁免功能中发挥重要作用［12-13］。本课题组前期研究发现五子衍宗丸复方及枸杞多糖，菟丝子黄酮可有效干预热应激后导致的血睾屏障破坏及生精细胞的凋亡［14-16］。此外，有研究发现热应激可诱发机体各种炎症反应［17-19］。因此推测急性热应激会引起睾丸内免疫微环境变化，该变化可能诱发了炎症反应。

血睾屏障由多种支持细胞膜蛋白（如ZO-1、occludin 和claudins）组成，是睾丸免疫耐受的结构基础［20］。其可限制大分子物质，特别是蛋白质通过细胞间隙，确保曲细精管与间质内的环境显著不同，并为生精细胞的正常发育创造了独特的环境，保证生精细胞免受免疫系统的影响［21］。一旦紧密连接结构相关蛋白表达缺失，破坏了睾丸的免疫豁免屏障，则有可能导致自身免疫炎症反应的发生［22］。而vimentin 出现在支持细胞的基底和核周区域，并向顶端细胞质辐射，负责将生精细胞锚定到生精上皮［23］。与血睾屏障共同维持睾丸的免疫豁免环境。vimentin 塌陷会破坏生精上皮结构的完整性，造成生精细胞脱落、凋亡［24］。本研究结果表明急性热应激后0.5 h 即出现睾丸内生精上皮结构和血睾屏障通透性被破坏，并且热应激后48 h 内破坏程度随着时间的增长有增强的趋势。提示急性热应激生精障碍早期干预治疗对减轻睾丸组织损伤十分关键。

NF-κB p65 是存在于胞浆中的一种核转录因子，参与并调控炎症反应和免疫应答。细胞在静息状态下，NF-κB p65 与IκBα 相结合，以聚合物的形式存在于胞浆内，无转录活性［25］。当受到外界刺激时，IκBα 磷酸化，随即从聚合体中解离，再经泛素化修饰后，IκBα 发生降解［26-27］。而受到IκBα 抑制的NF-κB p65 得以解离并迅速进入细胞核内，发生磷酸化并诱导产生炎症介质（如IL-1、TNF-α、IL-6等）［28］。本实验结果证明急性热应激6 h 以后NF-κB 信号通路才被激活，其中24 h 和48 h 差异最显著。因此实验检测了这两个时间点热应激大鼠睾丸内IL-1β 的表达变化。IL-1β 是由NF-κB 信号通路调控的下游重要炎症相关因子之一，能够阻遏睾酮合成蛋白酶基因的表达和转录，阻碍精子发生，降低精子活力，减少精子数量，从而导致不育［29-30］。有趣的是，本实验结果表明，虽然NF-κB 信号通路被激活，但睾丸内炎症因子却没有增多，并未发生免疫炎症反应。这可能是因为睾丸内免疫豁免功能由多种具有免疫抑制功能的细胞和复杂的细胞因子网络共同构成和调节［7，31］。急性热应激的刺激程度未超出睾丸免疫抑制的调节范围。

综上所述，本研究结果表明急性热应激在早期即可破坏睾丸内血睾屏障及生精上皮结构，破坏睾丸免疫豁免的屏障，同时在中期即激活NF-κB 信号通路。但该热激刺激并未导致下游炎症因子增多，未诱发炎症反应。有研究表明，持续性的热刺激更能诱发睾丸产生明显的炎症反应和相应的炎症损伤［32-33］。热应激诱发睾丸局部炎症反应需要时间界点和温度阈值。因此，继续加大热刺激程度观察睾丸内免疫微环境的改变及其对睾丸组织细胞的影响，将是本课题组今后的研究重点。