红景天苷对高糖条件下血管内皮细胞凋亡和氧化应激的调节作用

范二红 鲁 平

1 西华第一医院内分泌科，河南省周口市 466600； 2 河南省人民医院内分泌科

2型糖尿病是我国最常见的内分泌代谢性疾病，具有发病率逐年升高但血糖控制达标率较低的流行病学特点。心脑血管并发症是2型糖尿病常见的并发症，血管内皮损伤是与糖尿病血管并发症发生密切相关的病理环节，长期血糖升高能够通过细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等途径来引起内皮损伤[1-2]。因此，减轻高糖环境所引起的血管内皮损伤是防治糖尿病血管并发症的重要靶点。红景天苷是中药红景天中的活性成分，具有改善微循环、保护细胞等生物学作用。国内姜晓斐等研究报道红景天苷能够减轻低氧引起的内皮损伤[3]，但红景天苷对高糖引起内皮损伤的保护作用及机制尚未明确。为此，本研究具体分析了红景天苷对高糖条件下血管内皮细胞凋亡和氧化应激的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人脐静脉内皮细胞(HUVECs，ATCC公司)，红景天苷(中国药品生物制品检定所)，凋亡检测试剂盒(TUNEL法，上海碧云天公司)，mRNA表达检测试剂盒(北京康为世纪公司)，Bax、Bcl-2、Caspase-3、NOX2、NOX4的第一抗体购自Abcam公司，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组：HUVEC在含有10%胎牛血清的培养基中进行培养，细胞密度生长至85%～90%时，用0.25%的胰酶对细胞进行消化，离心收集消化后的细胞并进行常规传代。传代后接种在培养板中的细胞分为三组：对照组用低糖培养基(5.5mmol/L葡萄糖)处理，高糖组用高糖培养基(33mmol/L葡萄糖)处理，红景天苷组用含有10μg/ml红景天苷的高糖培养基处理。

1.2.2 细胞凋亡率的检测：不同条件处理24h后，弃去培养基并用磷酸盐缓冲液清洗细胞2遍，用TUNEL法进行凋亡检测，按照试剂盒说明书进行操作后在显微镜下观察TUNEL阳性细胞、DAPI阳性细胞，计数后计算细胞凋亡率。

1.2.3 基因mRNA及蛋白表达的检测：不同条件处理24h后，弃去培养基并用磷酸盐缓冲液清洗细胞2遍，加入Trizol裂解液提取RNA后进行荧光定量PCR反应，根据反应曲线计算Bcl-2、Bax、Caspase-3、NOX2、NOX4的mRNA表达水平；加入RIPA裂解液提取蛋白后进行western blot检测，完成电泳、封闭、抗体孵育后通过ECL系统检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、NOX2、NOX4的蛋白表达水平。

1.2.4 氧化应激产物的检测：不同条件处理24h后，取细胞培养基采用MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒测定MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0软件处理数据，三组间计量资料的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组间细胞凋亡率比较 对照组的细胞凋亡率为(9.82±1.35)%、高糖组的细胞凋亡率为(33.58±6.61)%、红景天苷组的细胞凋亡率为(15.23±2.24)%。与对照组比较，高糖组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与高糖组比较，红景天苷组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。

2.2 三组间凋亡相关基因表达比较 与对照组比较，高糖组细胞中Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表达水平明显升高，Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)；与高糖组比较，红景天苷组细胞中Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表达水平明显降低，Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 三组间凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3比较

2.3 三组间氧化应激相关基因表达比较 与对照组比较，高糖组细胞中NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与高糖组比较，红景天苷组细胞中NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 三组间氧化应激相关基因NOX2、NOX4比较

2.4 三组间氧化应激产物含量比较 与对照组比较，高糖组细胞培养基中MDA的含量明显升高，SOD、GSH-Px含量明显降低(P<0.05)；与高糖组比较，红景天苷组细胞培养基中MDA含量明显降低，SOD、GSH-Px含量明显升高(P<0.05)。见表3。

表3 三组间氧化应激产物MDA、SOD、GSH-Px比较

3 讨论

2型糖尿病患者血糖控制不佳会增加心脑血管并发症的发生率。血糖控制不佳会导致患者长期处于高糖环境，血管内皮细胞在高糖的刺激下会发生损害并参与血管并发症的发生。近年来，血管内皮损害与心脑血管疾病间的密切关系受到了越来越多的关注，血管内皮作为血液与血管壁之间的机械屏障，发生损害后会造成血小板、炎症细胞等在损伤局部浸润并逐步形成血栓，不加以干预会最终发展为血栓栓塞[4-5]。红景天苷是我国传统中药材红景天中的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，已经被证实能够减轻过氧化氢所引起的视网膜色素水平细胞损害、缺氧引起的神经元损害、糖基化终末产物引起的内皮损害[6]。本研究将红景天苷用于高糖引起内皮细胞损伤的干预，通过观察细胞凋亡情况可知：高糖组的细胞凋亡率明显高于对照组，而红景天苷组的细胞凋亡率明显低于高糖组，提示红景天苷能够减轻高糖引起的内皮细胞凋亡。

细胞内线粒体凋亡途径的过度激活是与高糖、缺氧、氧自由基增多等病理条件引起内皮细胞凋亡密切相关的病理环节[7]。Bax和Bcl-2是线粒体膜上通过改变细胞色素C通透性来调节细胞凋亡的一对分子，Bax能够通过形成同源二聚体来促进细胞色素C的通透、使线粒体内的细胞色素C大量进入细胞浆并通过激活Caspase-3来介导细胞凋亡[8]；Bcl-2能够与Bax形成异源二聚体、阻碍细胞色素C的通透，进而抑制细胞色素C对Caspase-3的激活、阻碍细胞凋亡的发生[9]。本研究分析显示：高糖处理后细胞中Bax、Caspase-3表达增加，Bcl-2表达降低，表明高糖激活了线粒体途径凋亡；高糖处理的同时加用红景天苷后，细胞中Bax、Caspase-3表达降低，Bcl-2表达增加，表明红景天苷能够抑制高糖条件下内皮细胞中线粒体途径凋亡的激活。

线粒体途径凋亡的过度激活是线粒体功能在高糖环境下发生紊乱的表现之一，除此之外，线粒体功能紊乱还会影响氧化呼吸链中的电子传递发生障碍、游离电子向氧分子转移并产生氧自由基，进而通过氧自由基介导的氧化应激反应来造成细胞损伤[10]。NOX2和NOX4是NOXs家族中参与内皮细胞线粒体内电子转移过程的成员，高表达的NOX2和NOX4能促进游离电子及氧自由基的产生，与细胞膜上的脂质发生氧化反应并造成细胞损伤，同时使氧化产物MDA的生成及抗氧化酶SOD及GSH-Px的消耗增多[11]。本研究对高糖条件下HUVEC中以上氧化应激基因及产物的分析显示：高糖处理后细胞培养基中MDA的含量及NOX2、NOX4的表达水平增加，SOD、GSH-Px的含量降低，表明高糖激活了氧化应激反应；高糖处理的同时加用红景天苷后，培养基中MDA的含量及NOX2、NOX4的表达水平降低，SOD、GSH-Px的含量增加，表明红景天苷对高糖诱导内皮细胞中氧化应激反应的激活具有抑制作用。

综上所述，红景天苷对高糖条件下血管内皮细胞的凋亡和氧化应激具有抑制作用，未来可进一步通过动物实验来验证红景天苷对糖尿病大鼠内皮功能的保护作用。