miR-495-3p联合黄氏总皂苷对高糖诱导的成骨细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

2021-04-09刘亚东卢小伟

安徽医药 2021年4期

刘亚东，卢小伟

作者单位：湖北医药学院附属东风医院骨外科，湖北十堰442000

骨质疏松症是中老年人最常见的骨科疾病，随着中国社会老龄化，骨质疏松症发病率逐步上升，而骨折是最常见也是最严重的并发症。糖尿病性骨质疏松症（Diabetic osteoporosis，DOP）是糖尿病的并发症之一，以糖尿病为特征，伴随着骨量减少、骨组织微结构改变、骨强度降低和骨脆性增加。DOP是一种继发性骨质疏松症，2型糖尿病被认为骨质疏松症相关骨折的危险因素。目前，DOP的发病机制尚不清楚。既往研究表明，高糖环境下，成骨细胞的增殖受抑制，凋亡率明显升高。黄芪总皂苷（Total saponins of Astragalus membranaceus，TSA）是黄芪主要的活性成分之一，现阶段已分离得到包括黄芪皂苷Ⅰ-Ⅷ在内的40多种三萜皂苷类成分。资料显示，TSA可促进小肠上皮细胞、神经干细胞NSCs的增殖。由黄芪等药材制成的黄芪散可以促进高糖作用下的成骨细胞增殖。黄芪注射剂可以明显提高22例DOP病人的骨密度，取得较好疗效。然而，TSA 作用于DOP的研究鲜见报道。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类高度保守的非编码RNA。报道指出，微小RNA-495-3p（miR-495-3p）通过调节胃癌发生过程中的多种表观遗传修饰因子起到肿瘤抑制剂的作用，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）处理显著下调人牙周膜细胞这miR-495-3p 表达，但miR-495-3p对成骨细胞的作用尚不明确。因此，2018年2月至2019年4月，本研究利用高糖诱导商购小鼠的细胞MC3T3-E1构建DOP模型，观察黄芪总皂苷对高糖培养的MC3T3-E1细胞增殖、凋亡的影响，并结合miR-495-3p探寻其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂

小鼠成骨细胞系MC3T3-E1购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，黄芪总皂苷（纯度≥98%）购自源叶生物公司，DMEM 培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，葡萄糖、噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（Dimethyl sulphoxide，DMSO）购自美国Sigma 公司，RIPA 裂解液购自美国Millipore 公司，miRNA 提取试剂盒购自上海Qiagen公司，Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）购自上海生工生物工程公司，胰酶、凋亡试剂盒购自上海碧云天生物有限公司，逆转录试剂盒、实时定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自美国应用生物系统公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，β肌动蛋白（β-actin）抗体、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleave-caspase-3）抗体购自美国Cellular Signaling Technology 公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德生物有限公司。

1.2 细胞培养、细胞转染及分组

MC3T3-E1细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养。每周换液2～3次，胰酶消化后进行接种传代。转染时，以1×10个/mL的细胞密度接种于6孔板，待其生长至80%融合度时，严格按照Lipofectamine 2000 试剂说明书进行，将miR-495-3p、抗miR-495-3p（anti-miR-495-3p）及各自阴性对照转染入MC3T3-E1细胞，转染稳定后收集细胞用于后续实验。

细胞用随机数表法随机分为对照（NC）组（MC3T3-E1 细胞），高糖组（30 mmol/L 葡萄糖+MC3T3-E1细胞），高糖+不同浓度TSA 组（高糖+0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL TSA+MC3T3-E1 细胞），高糖+miRNA阴性对照（miR-con）组（高糖+转染miR-con），高糖+miR-495-3p组（高糖+转染miR-495-3p），高糖+TSA+抗miRNA阴性对照（anti-miR-con）组（高糖+2.0 μg/mL TSA+转染anti-miR-con），高糖+TSA+anti-miR-495-3p（高糖+2.0 μg/mL TSA+转染anti- miR-495-3p）。其中，TSA作用时间为48 h。

1.3 MTT法检测细胞增殖

收集各组MC3T3-E1细胞，加入胰酶消化，以1×10个/孔的细胞密度接种于96孔板，培养48 h，加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清液，加入DMSO 200 μL，37 ℃摇床孵育10 min，于酶标仪测定细胞490 nm 波长处吸光度值（OD值），根据公式计算细胞存活率。细胞存活率（%）=实验组OD/对照组OD×100%

1.4 细胞凋亡实验

胰酶消化各组MC3T3-E1细胞，以5×10个/mL，加入500 μL Annexin V缓冲液重悬细胞，随后将细胞转移至EP管，在室温黑暗条件下用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 孵育30min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 qRT

PCR 检测miR

495

3p 的表达水平

利用miRNA 提取试剂盒提取MC3T3-E1 细胞中总miRNA，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以制成的cDNA 为模板，U6 为参照，进行qRT-PCR 反应。miR-495-3p 正向引物序列为5'-TCAATAAATTTGGTGGTCCTCGG-3'，反向引物序列为5'-TAGGCCTTGCACGAAGATGG-3'。反应结束后，收集Ct值，以2法分析miR-495-3p相对表达量。

1.6 Western blotting 检

测CyclinD1、Cleave

cas

pase

3蛋白表达

在各组细胞中加入RIPA裂解液，充分提取总蛋白，10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，之后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在5%脱脂奶粉中封闭1 h。加入一抗（1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜，TBST充分洗膜后与二抗（1∶5000稀释）室温孵育1h，加入TBST充分洗膜。置于化学发光液中显色、显影，以β-actin为参照，分析CyclinD1、Cleave-caspase-3相对表达量。

2 结果

2.1 不同浓度TSA对成骨细胞MC3T3

E1（高糖）增殖的影响

MTT检测结果显示，与NC细胞组比较，高糖组MC3T3-E1细胞存活率大幅减少（

＜0.05）。与高糖细胞组比较，高糖与0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL 浓度TSA 组MC3T3-E1细胞存活率明显升高，并呈剂量依赖性（

＜0.05）。后续实验选择2.0 μg/mL的TSA浓度进行相关研究。见表1。

表1 不同浓度TSA抑制成骨细胞MC3T3-E1（高糖）增殖/（%，±s）

2.2 TSA对成骨细胞MC3T3

E1（高糖）凋亡的影响及qRT

PCR检测miR

495

3p的表达水平

流式细胞仪检测结果显示，相比于NC细胞组，高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著升高（

＜0.05）。相比于高糖细胞组，高糖与2.0 μg/mL TSA组明显减少MC3T3-E1细胞凋亡率（

＜0.05）。Western blotting检测结果表明，与NC细胞组比较，高糖显著增加MC3T3-E1细胞Cleavecaspase-3表达量（

＜0.05）。与高糖细胞组比较，高糖与2.0 μg/mL TSA组显著降低MC3T3-E1细胞Cleavecaspase-3蛋白水平（

＜0.05）。qRT-PCR 检测结果显示，与NC细胞组相比，高糖组MC3T3-E1细胞中miR-495-3p 表达量大幅减少（

＜0.05）。与高糖细胞组相比，高糖与2.0 μg/mL TSA组明显增加MC3T3-E1细胞中miR-495-3p表达量（

＜0.05）。见表2，图1，。

表2 TSA对成骨细胞MC3T3-E1（高糖）凋亡的影响/±s

图1 TSA对成骨细胞MC3T3-E1（高糖）凋亡的影响：A为Western blotting检测Cleave-caspase-3蛋白表达；B为流式细胞仪检测细胞凋亡

2.3 miR

495

3p 促进成骨细胞MC3T3

E1（高糖）增殖，抑制凋亡

与NC 细胞组比较，高糖明显降低MC3T3-E1 细胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表达量，提高细胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，均差异有统计学意义（

＜0.05）。与高糖+miR-con 组比较，过表达miR-495-3p 明显提高高糖诱导的MC3T3-E1 细胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表达量，降低细胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，均差异有统计学意义（

＜0.05）。见表3，图2。

2.4 低表达miR

495

3p 可以逆转TSA 对成骨细胞MC3T3

E1（高糖）增殖和凋亡的影响研究

高糖与2.0 μg/mL TSA 组明显提高MC3T3-E1 细胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 水平，显著降低细胞凋亡率和Cleave-caspase-3表达量（

＜0.05）。与高糖+TSA+anti-miR-con 组相比，高糖、2.0 μg/mL TSA 和转染antimiR-495-3p组显著降低MC3T3-E1细胞存活率、miR-495-3p 和CyclinD1 表达量，明显提高细胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平（

＜0.05）。见图3，表4。

3 讨论

本研究以高糖诱导成骨细胞损伤，这种模型构建方式前人早有报道。吴娟等发现高糖高脂以时间依赖方式抑制成骨细胞增殖活性，促进细胞凋亡并上调cleaved caspase-3 表达。颜晓芳等指出间歇性高糖明显降低成骨细胞中CyclinD1 及β-连环蛋白（β-catenin）、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）水平。本研究中，高糖明显减少MC3T3-E1 细胞存活率和CyclinD1 表达量，增加细胞凋亡率和Cleavecaspase-3表达（

＜0.05），这与上述研究一致。

表3 miR-495-3p促进成骨细胞MC3T3-E1（高糖）增殖，抑制凋亡/±s

表4 低表达miR-495-3p可以逆转TSA对成骨细胞MC3T3-E1（高糖）增殖和凋亡的影响研究/±s

图2 Western blotting检测过表达miR-495-3p对高糖诱导CyclinD1和Cleave-caspase-3的影响

图3 低表达miR-495-3p可以逆转TSA对成骨细胞MC3T3-E1（高糖）增殖和凋亡的影响（Western blotting检测）

黄芪总皂苷TSA 从药用植物黄芪提取而来，是黄芪主要的活性成分，对各种类型的癌症表现出抗肿瘤能力，还具有降血糖、抗炎、抗病毒、抗氧化和免疫调节等活性。黄芪可以改善血糖水平，在糖尿病及其并发症治疗中拥有广泛的应用前景。不同配比的黄芪总皂苷和姜黄素联用对糖尿病模型大鼠具有良好的治疗效果。以往的资料显示，黄芪提取物或多糖对成骨细胞具有一定调节能力，可有效缓解大鼠卵巢切除诱导的骨质疏松症。黄芪甲苷I刺激成骨细胞MC3T3-E1中β-连环蛋白和Runt家族相关转录因子2的表达，通过Wnt/β-连环蛋白信号通路刺激成骨细胞分化。大鼠成骨细胞加入不同体积分数的黄芪注射液分别培养3、5、7、9天，成骨细胞的增殖能力得到显著促进，并呈现量效趋势。黄芪甲苷IV 可作为促进骨整合的生长因子，激活Hedgehog信号通路并显著促进人成骨细胞样细胞增殖和迁移。然而TSA对高糖培养成骨细胞增殖和凋亡的影响尚未可知。本实验中，TSA 明显增加高糖诱导的MC3T3-E1细胞存活率和CyclinD1蛋白表达量，降低MC3T3-E1细胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平，提示黄芪总皂苷可以改善高糖诱导的成骨细胞损伤，促进高糖诱导的成骨细胞增殖并抑制其凋亡，与前人对黄芪及其皂苷促进成骨细胞增殖作用相符。

miRNA 是一种短链非编码RNA，其通过引起靶mRNA 的降解或翻译抑制来调节转录后的基因表达。已有证据表明，miRNA参与高糖刺激的成骨细胞分化过程，例如miR-335-5p，miR-424，miR-449。研究发现，miR-590-5p 过表达减弱高糖对MC3T3-E1生长的抑制作用，显著促进成骨细胞生长和分化。然而，miR-495-3p是否会影响高糖条件下MC3T3-E1细胞生长仍然知之甚少。本研究中，高糖刺激MC3T3-E1 细胞，导致miR-495-3p 表达量减少，这说明在高糖条件下，miR-495-3p可能在成骨细胞功能中起重要作用。过表达miR-495-3p显著提高高糖诱导的MC3T3-E1细胞存活率、CyclinD1表达量，降低细胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，证明miR-495-3p促进高糖诱导的成骨细胞增殖并抑制其凋亡，这与黄芪总皂苷的效果相似。在MC3T3-E1 细胞中转染anti-miR-495-3p，进一步考察TSA保护高糖损伤成骨细胞的机制，发现低表达miR-495-3p可以逆转TSA促进高糖诱导的MC3T3-E1 增殖作用和抑制其凋亡作用，表明调控miR-495-3p可能是黄芪总皂苷发挥保护高糖损伤成骨细胞功能的重要机制之一。

综上所述，黄芪总皂苷可以改善高糖诱导的成骨细胞损伤，抑制其增殖并诱导凋亡，其作用机制与调控miR-495-3p 表达有关，这为理解糖尿病性骨质疏松症的机制提供了理论基础，也为黄芪的开发和临床应用提供了新思路。但是关于黄芪总皂苷保护高糖损伤成骨细胞的具体机制有待于进一步探索。