长春新碱逆转骨髓间充质干细胞对白血病儿童门冬酰胺酶耐药的研究*

徐清云 卢婕伦 曾晓珍 卫风桂 吴泽霖 邹亚伟

广州医科大学附属第一医院儿科，广东省广州市 510000

联合应用左旋门冬酰胺酶(L-asp)治疗后，儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的完全缓解率及长期无病生存率有了显著提高[1]，作为儿童ALL化疗的一线药物，L-asp在ALL患儿诱导缓解中有着不可替代的地位，却容易产生耐药[2]，对L-asp治疗的耐药与其临床疗效差存在直接相关性。关于L-asp的耐药机制，目前尚未有定论，但有研究表明，可能与白血病细胞赖以生存的骨髓微环境中骨髓间充质干细胞(MSCs)的ASNS高表达有关[3]。白血病的发生发展过程中，骨髓间充质干细胞通过直接黏附和分泌细胞因子等机制对白血病细胞增殖、分化、迁移、凋亡有重要作用[4-5]。白血病细胞与骨髓微环境的相互作用成为研究儿童白血病耐药的一个重要方面。从干扰或切断ALL细胞与MSCs的联系着手，可能会找到更多解决门冬酰胺耐药问题的办法，从而改善ALL的预后。现今儿童ALL常用化疗方案中均采用长春新碱(VCR)和L-asp序贯治疗[6]。VCR预处理MSCs，能否降低MSCs中ASNS的表达并逆转共培养系统中MSCs介导的L-asp耐药，这尚有待证实。本项目研究以体外模拟骨髓微环境中的白血病细胞为靶点，建立骨髓间充质干细胞—白血病细胞共培养模型，并对其进行L-asp处理。通过比较L-asp处理前后白血病细胞的凋亡情况及其ASNS mRNA的表达水平，评估MSCs对白血病儿童L-asp治疗耐药的影响,并探索VCR能否逆转MSCs介导的白血病细胞对门冬酰胺酶耐药及其机制，为进一步理解L-asp的化疗耐药机制并克服ALL细胞对L-asp的耐药问题奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 Ficol淋巴细胞分离液(天津TBD 公司)，胎牛血清(美国Hyclone 公司)，低糖DMEM 培养基(DMEM-LG)，1640 培养液(美国Gibco 公司)，流式细胞术、抗体(美国BD PharMingen公司)，核酸提取、逆转录试剂盒(Bio-Rad公司)、qPCR试剂盒(Thermo公司)，引物(Invitrogen公司)，低温高速离心机(Beckman公司)，细胞培养箱(SANYO公司)，倒置光学显微镜(Leica 公司)，PCR仪C1000(Bio-RAD公司)，实时荧光定量PCR仪ABI-7900HT(ABI公司)。

1.2 标本采集 所有病例来自广州医科大学附属第一医院儿科ALL患儿。在知情同意下收集15例ALL患儿骨髓标本，其中初治3例，化疗缓解或部分缓解12例，平均年龄(5.53±3.18)岁，男7例，女8例。15例骨髓标本全部用于体外培养，12例化疗缓解或部分ALL骨髓标本经分离培养及传代后进行后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1 MSCs的体外分离、培养及鉴定：MSCs的体外分离、培养方法参考相关文献[7]，用流式细胞仪检测MSCs的免疫表型。

1.3.2 MTT 法检测细胞株Jurkat L-asp IC50浓度：取对数生长期的Jurkat细胞，按1×105/孔，L-asp的终浓度分别为0.00、0.01、0.10、1.00、10.00IU/ml，每一浓度设6个复孔；培养48h，加入MTT(5mg/ml)/孔，4h后终止培养，离心、吸掉上清；加入DMSO溶解MTT，酶标仪490nm测A值；重复实验3次。

1.3.3 建立MSCs-Jurkat共培养模型：取第2～5代MSCs按2×104/ml 的密度接种，待细胞铺满孔底80%～90%时，加入1 800μl(细胞悬液∶生理盐水=19∶1，每孔共2 000μl)按5×105/ml密度重悬的Jurkat细胞，建立MSCs-Jurkat共培养模型，为共培养对照组；共培养实验组1为加入IC50浓度的L-asp 200μl[细胞悬液∶L-asp(IC50的浓度)=19∶1，每孔共2 000μl]处理组共培养模型，培养48h后终止培养，收取Jurkat细胞；共培养实验组2为加入含VCR 0.1μmol/ml(浓度相当于临床用药浓度)的低糖DMEM完全培养液2 000μl预处MSCs，培养72h(VCR的生物半衰期在25.5h左右)后弃培养液，清洗，用VCR处理后的MSCs与Jurkat细胞建立共培养模型，后续步骤同共培养实验组1。

1.3.4 细胞凋亡率的测定：收集各组Jurkat细胞，冲洗后按每(1～5)×105细胞加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI，室温避光染色15min；用AnnexinV-FITC/PI双参数法流式细胞术定量测定细胞凋亡率(每组重复实验3次)。

1.3.5 Real-Time qPCR检测ASNS mRNA表达：ASNS cDNA提取步骤参考相关文献[8]，引物设计在Pubmed网站中查出Genebank提供的GAPDH和ASNS的 mRNA 序列，采用Primer premier 5.0软件设计目的基因引物：SYBR实时荧光定量PCR引物序列GAPDH上游：5’-AATCCCATCACCATCTTCCA-3’，下游：5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’产物大小77bp；ASNS上游：5’-GGCAAATGCAGCCCAGAAAT-3’，下游：5’-GGCGTTCAAAGACTTGACGG-3’，产物大小80bp。扩增的具体循环参数95℃ 3min；95℃3s，60℃20s，共40个循环；95℃5s，60℃1min，97℃30s。记录Ct值并进行数据分析。计算公式：目的(ASNS)mRNA的表达量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的-Ct内参)实验组-(Ct目的-Ct内参)对照组，Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数，根据Ct值计算ASNS mRNA进行相对定量。目的基因的Ct值通过内参基因的Ct值进行校正。

2 结果

2.1 MSCs原代分离培养后流式细胞术鉴定 分离扩增的MSCs表达CD105、CD29、CD90阳性，CD14、CD19、CD11B、CD79a、HLADR、CD34和CD45表达阴性(图1)，符合MSCs抗原标志物表达特征，且随着细胞的传代免疫表型无变化[9]。

图1 MSCs鉴定

2.2 白血病细胞株Jurkat IC50的测定 急性白血病细胞株Jurkat经不同浓度L-asp(0.01IU/ml、0.1IU/ml、1IU/ml、10IU/ml)处理48h后细胞存活率分别为(76.33±3.44)%、(57.23±3.55)%、(50.17±3.09)%、(39.27±4.37)%，可知Jurkat细胞株L-asp IC50浓度为(1.08±0.86)IU/ml。

2.3 共培养及L-asp对Jurkat细胞凋亡率的影响 通过FITC-PI双染色法检测Jurkat细胞凋亡率，FITC-Annexin V(+)/PI(-)细胞的百分比(A4象限)，即为凋亡率。见图2。

图2 1例标本不同培养及处理组中Jurkat细胞凋亡率

2.3.1 L-asp对Jurkat细胞株凋亡率影响:通过流式细胞仪检测Jurkat细胞株的凋亡率，发现单独培养的Jurkat经L-asp处理后细胞凋亡率(36.83±5.69)%较对照组的(24.83±1.99)%增高，差异有统计学意义(P<0.01)；同时发现L-asp处理的共培养实验组1中Jurkat凋亡率(17.83±3.80)%也较共培养对照组(9.15±3.21)%高，差异有统计学意义(P< 0.01)。

2.3.2 MSCs对Jurkat细胞株凋亡率的影响:共培养对照组中Jurkat凋亡率(9.15±3.21)%较单独培养对照组(24.83±1.99)%低，差异有显著统计学意义(P<0.01)。且L-asp处理的共培养实验组1(17.83±3.80)%比单独培养实验组Jurkat凋亡率(36.83±5.69)%低，差异有显著统计学意义(P<0.01)，说明MSCs对Jurkat细胞有保护作用。

2.3.3 VCR预处理MSCs对Jurkat细胞株凋亡率的影响：VCR预处理的共培养实验组2 Jurkat凋亡率(25.87±4.68)%较无VCR预处理共培养实验组1(17.83±3.80)%高，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明VCR预处理MSCs可降低MSCs对Jurkat细胞的保护作用。

2.4 共培养及L-asp对Jurkat细胞ASNS mRNA的影响

2.4.1 L-asp对Jurkat细胞株ASNS mRNA表达的影响：通过RT-PCR检测ASNS表达水平，在单独培养组中，L-asp处理后ASNS mRNA表达水平升高(2-ΔΔCt=1.846±0.038，P<0.05)；在共培养组中，L-asp处理后ASNS mRNA表达水平也升高(2-ΔΔCt=4.102±2.212，P<0.05)，差异有统计学意义。

2.4.2 MSCs对Jurkat细胞株ASNS mRNA的表达的影响：共培养对照组中ASNS mRNA的表达水平比Jurkat细胞单独培养对照组低(2-ΔΔCt=0.057±0.030)，差异有统计学意义(P<0.05)。但L-asp处理的共培养组实验组1与单独培养实验组ASNS的mRNA表达水平无明显变化(2-ΔΔCt=1.296±1.091)，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4.3 VCR预处理MSCs对Jurkat细胞株ASNS mRNA表达的影响：VCR预处理的共培养实验组2 ASNS mRNA的表达水平较无VCR预处理共培养实验组1无明显变化(2-ΔΔCt=1.101±0.586)，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

目前对BM-MSCs的分离鉴定主要有三个方面：梭形细胞，呈贴壁性生长；细胞表面分子阳性和阴性选择标记；自身增殖能力强，具有多向分化能力[9]。作为骨髓微环境主要组成部分之一，MSCs可以通过阻止药物渗透入肿瘤细胞促进抗药性(被动性)，也通过分泌保护细胞因子或改变肿瘤细胞基因转录覆盖的抗癌药物的细胞毒作用(主动性)[4,10,11]。

与其他抗肿瘤药物相比，L-asp的疗效好、骨髓抑制等不良反应相对较轻，临床研究表明ALL的预后和门冬酰胺酶治疗的剂量强度有直接关系[1,6]。然而，L-asp耐药限制了其在ALL中发挥更好的疗效，人们观察到对L-asp治疗耐药与其临床疗效差存在直接相关性，通常认为L-asp耐药这可能与谷氨酰胺依赖性天冬酰胺合成酶(ASNS)酶的上调有关[2]。但是，一项临床ALL样本中ASNS mRNA水平的研究质疑了ASNS在L-asp耐药性中的重要性。在16个细胞系中，ASNS基线基因表达模式将L-asp敏感性与耐药性区分开来。但是，对于28个儿科ALL样本，没有一致的基线表达模式与对L-asp敏感性相关[12]。这些结果表明，ALL样本中ASNS以外的因素会影响L-asp的易感性。直到Iwamoto等人[3]发现MSCs细胞可分泌大量的ASNS，补充ALL细胞L-asp化疗后门冬酰胺的消耗而导致耐药。

在本研究中，L-asp处理单独培养组后，Jurkat细胞株细胞凋亡率升高，其ASNS的mRNA表达水平升高，说明Jurkat细胞株对L-asp敏感，L-asp消耗ASN后可至Jurkat细胞株中ASNS代偿性升高；用L-asp处理共培养组后，Jurkat细胞的凋亡率也有升高，但ASNS mRNA表达水平明显降低，这提示共培养组中MSCs可通过减少Jurkat细胞株的凋亡从而影响L-asp治疗的敏感性，其ASNS mRNA的表达降低，可能是因共培养模型中的MSCs高表达ASNS mRNA，从而减少Jurkat细胞株ASNS mRNA的表达。

在评估MSCs对Jurkat的影响时笔者发现，共培养组中Jurkat凋亡率较单独培养组低，其ASNS mRNA表达水平明显降低；L-asp处理的共培养组与单独培养组相比，Jurkat细胞株的凋亡率也降低，ASNS mRNA的表达水平却无明显变化。说明骨髓MSCs虽然可以增强Jurkat细胞株的抗凋亡能力，但在共培养模型中L-asp仍可起部分作用，MSCs高表达ASNS mRNA并抑制Jurkat中ASNS mRNA的表达，L-asp可使Jurkat中ASNS mRNA的表达升高，在MSCs与L-asp两者的共同作用下，共培养组中Jurkat细胞株的ASNS mRNA表达无明显变化。

现今儿童ALL常用化疗方案中均采用长春新碱(VCR)和L-asp序贯治疗，这种序贯治疗的原则是，VCR可能有助于抑制对L-asp的过敏性反应[6]。同时，Li等[13]的研究发现，MSCs对抗微管药物敏感，如VCR。Fung等[14]的研究结果发现通过VCR预处理共培养系统中的MSCs，可抑制部分MSCs对ALL保护作用。在本实验中用VCR预处理MSCs后，共培养组中Jurkat细胞株的凋亡率升高，证实了这理论。假设VCR可通过抑制MSCs ASNS mRNA的表达，减少天冬酰胺的分泌来抑制对ALL的保护作用，那么经VCR预处理的共培养组中Jurkat细胞株经L-asp诱导后其内源性ASNS mRNA的表达水平会升高。而本实验数据却显示内源性ANSN mRNA的表示水平只是稍有升高，差异无统计学意义。

究其原因，可能为VCR预处理MSCs后，只是部分抑制了MSCs的作用，而MSCs高表达ASNS mRNA，仍可部分或少量表达ASNSmRNA，分泌一些门冬酰胺来补偿L-asp引起的消耗，因而共培养组中Jurkat细胞株不受L-asp的细胞毒性而致ASNS mRNA表达升高，比较L-asp处理的单独培养组的凋亡率比共培养组高，与这一假设吻合。另一可能原因是VCR预处理MSCs 3d后，洗掉残留的VCR，再用此MSCs共建培养组培养2d，此时MSCs细胞的已部分得到恢复，可部分表达ASNSmRNA。Li等[13]的研究也发现，予临床用药浓度VCR(0.1μmol/L),处理MSCs 3d后，可使MSCs的早期及晚期凋亡率达57.7%，然而撤药后MSCs的凋亡率可得到部分恢复。

关于MSCs对白血病细胞的保护作用众多复杂，如，有研究发现在酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗慢性髓性白血病期间，成纤维细胞生长因子2(FGF2)在MSCs中的表达增加，并保护白血病细胞[15]。Park等[16]的研究表明基质细胞中蛋白激酶C-β(PKC-β)的表达对肿瘤细胞的植入和正常B1细胞的发育至关重要，抑制基质细胞中的PKC-β可减轻环境介导的耐药性。因此，不排除其他凋亡机制引起的共培养模型中Jurkat细胞株的凋亡率改变。

综上所述，本文再次阐明ALL儿童骨髓MSCs影响白血病细胞对治疗的敏感性及可能作用机制，下一步应该更深化相关机制及其与临床治疗反应、预后关系的研究，靶向MSCs或其分泌的因子可能是克服耐药问题的有效策略。