HPLC法同时测定3种红景天药材中5种化学成分的含量

吕秀梅 范芳芳 文检 范刚 张静 张艺

中圖分类号 R284 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）18-2515-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.16

摘 要 目的：建立同时测定大花红景天、狭叶红景天和长鞭红景天药材中没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸含量的方法，并比较3种红景天药材中5种化学成分的含量差异。方法：采用高效液相色谱法测定含量，色谱柱为WondaSil C18，流动相为乙腈-0.3%磷酸溶液（梯度洗脱），检测波长为275 nm，柱温为25 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL；采用GraphPad Prism 5.0软件对含量测定结果进行单因素方差分析和Tukeys多重比较。结果：没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸的检测进样量线性范围分别为0.020 48～0.614 4 ?g（r=0.999 7）、0.118～3.54 ?g（r=0.999 5）、0.010 84～0.325 2 ?g（r=0.999 7）、0.008 48～0.254 4 ?g（r=0.999 5）、0.004 1～0.123 ?g（r=0.999 5）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率分别为99.62%～104.92%（RSD=1.68%，n=9）、96.55%～100.69%（RSD=1.67%，n=9）、98.91%～103.39%（RSD=1.48%，n=9）、100.93%～104.98%（RSD=1.37%，n=9）、97.71%～103.89%（RSD=1.99%，n=9）。大花红景天中没食子酸、红景天苷、酪醇和咖啡酸含量均显著高于长鞭红景天，大花红景天中的红景天苷、咖啡酸含量均显著高于狭叶红景天，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01或P<0.001）。结论：该方法简便可行、结果准确，可用于同时测定大花红景天、狭叶红景天和长鞭红景天药材中没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸的含量。3种常见红景天药材中的化学成分含量存在较大差异，大花红景天中红景天苷的含量最高。

关键词 高效液相色谱法；单因素方差分析；Tukeys多重比较；红景天；没食子酸；红景天苷；酪醇；咖啡酸；对香豆酸；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of gallic acid， salidroside， tyrosol， caffeic acid and p-coumaric acid in Rhodiola crenulata， R. kirilowii and R. fastigiata， and to compare the content difference of 5 chemical components in 3 kinds of R. rosea. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on WondaSil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 275 nm， and the column temperature was 25 ℃. Sample size was 10 μL. GraphPad Prism 5.0 software was used for single factor variance analysis and Tukeys multiple comparison of content determination results. RESULTS： The linear ranges of gallic acid， salidroside， tyrosol， caffeic acid and p-coumaric acid were 0.020 48-0.614 4 ?g（r=0.999 7）， 0.118-3.54 ?g（r=0.999 5）， 0.010 84-0.325 2 ?g（r=0.999 7）， 0.008 48-0.254 4 ?g（r=0.999 5） and 0.004 1-0.123 ?g（r=0.999 5）， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 99.62%-104.92%（RSD=1.68%，n=9）， 96.55%-100.69%（RSD=1.67%，n=9）， 98.91%-103.39%（RSD=1.48%，n=9）， 100.93%-104.98%（RSD=1.37%，n=9）， 97.71%-103.89%（RSD=1.99%，n=9）， respectively. The contents of gallic acid， salidroside， tyrosol and caffeic acid in R. crenulata were higher than R. fastigiata； the contents of salidroside and caffeic acid in R. crenulata were significantly higher than R. kirilowii， with statistical significance （P<0.05，P<0.01 or P<0.001）. CONCLUSIONS： The method is simple， feasible and accurate， and can be used for simultaneous determination of gallic acid， salidroside， tyrosol， caffeic acid and p-coumaric acid in R. crenulata， R. kirilowii and R. fastigiata. There was great difference in the contents of chemical components in 3 kinds of common R. rosea， the content of salidroside is the highest in R. crenulata.

KEYWORDS HPLC； Single factor variance analysis； Tukeys multiple comparison； Rhodiola rosea； Gallic acid； Salidroside； Tyrosol； Caffeic acid； p-coumaric acid； Content

红景天为藏医临床常用药材，始载于《四部医典》[1]，藏语称为“索罗玛布”。《晶珠本草》[2]中记载：“大株红景天治瘟病时疫，清肺热，治脉病。”有研究表明，红景天具有抗缺氧、抗衰老、抗氧化等功效[3-7]，其有效活性成分主要为红景天苷、红景天素、没食子酸、酪醇等[8-10]。近年来，随着红景天的需求量激增，市场上出现许多近缘品种代用的现象。红景天及其常用近缘品种虽具有相似的化学成分，如红景天苷、酪醇等，但含量存在着差异[11-12]。

2015年版《中国药典》（一部）[13]规定大花红景天 [Rhodiola crenulata （Hk. f. et Thoms.） H. Ohba]为基源药材，2014年版《四川省藏药材标准》[14]中收载了狭叶红景天[R. kirilowii （Regel） Maxim]，而长鞭红景天[R. fastigiata （Hk. f. et Thoms.） S. H. Fu]野生资源储量相当丰富，且此3种红景天药材在四川省草原科学研究院红原县红景天种植基地均有规范化种植。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立了同时测定上述3种红景天药材中没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸含量的方法，并对不同药材样品中各成分含量进行了比较，以为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030型HPLC仪，包括脱气单元、泵单元、低压梯度单元、柱温箱、自动进样器及紫外-可见分光检测器（日本岛津公司）；SB-5200D型超声波清洗机（宁波新艺超声设备有限公司）；TDZ5-W型台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；BSA124S型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 试剂

没食子酸对照品（批号：110831-201204，纯度：>98%）、红景天苷对照品（批号：110818-201206，纯度：>98%）均购自中国食品药品检定研究院；酪醇对照品（批号：MUST-15080501，纯度：>98%）、对香豆酸对照品（批号：MUST-15091503，纯度：>98%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸对照品（成都普思生物科技股份有限公司，批号：0211-0020，纯度：>98%）；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

大花红景天、狭叶红景天、长鞭红景天药材样品各16批，均由本课题组野外实地采集所得，经成都中医药大学张艺研究员鉴定分别为景天科红景天属植物大花红景天[R. crenulata （Hk. f. et Thoms.） H. Ohba]、狭叶红景天[R. kirilowii （Regel） Maxim]、长鞭红景天[R. fastigiata （Hk. f. et Thoms.） S. H. Fu]的根与根茎。药材样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，7% A；10～20 min，7% A→14% A；20～30 min，14% A→15% A；30～50 min，15% A→20% A）；检测波长：275 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。在该色谱条件下，各成分峰之间分离度均大于1.5，理论板数以没食子酸峰计应不低于4 000，色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别称取没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸对照品各适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，分别加甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.512、1.180、0.542、0.848、0.205 mg/mL的单一对照品贮备液。分别精密吸取上述各单一对照品贮备液2、5、1、0.5、1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸质量浓度分别为20.48、118、10.84、8.48、4.1 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取药材样品细粉约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液50 mL，称定质量，超声（功率：200 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用70%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，以4 000 r/min离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、5、10、15、20、25、30 ?L，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分的进样量（x，?g）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

2.4 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸峰面积的RSD分别为0.96%、0.44%、1.23%、0.72%、0.81%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S1）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸峰面积的RSD分别为1.83%、1.78%、1.89%、1.91%、1.63%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本穩定。

2.6 重复性试验

精密称取药材样品（编号：S1）细粉约0.5 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸平均含量分别为1.393、11.313、1.043、1.194、0.347 mg/g，RSD分别为1.53%、1.61%、1.73%、1.76%、1.95%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的药材样品（编号：S1）细粉约0.25 g，共9份，分别加入“2.2.1”项下单一对照品贮备液各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.8 样品含量测定

分别取各批药材样品细粉适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4（注：“-”表示含量低于0.001 mg/g）。

采用GraphPad Prism 5.0软件对含量测定结果进行单因素方差分析和Tukeys多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果显示，大花红景天中的没食子酸、红景天苷、酪醇和咖啡酸含量均显著高于长鞭红景天，大花红景天中的红景天苷、咖啡酸含量均显著高于狭叶红景天，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01或P<0.001）；其中，红景天苷含量大花红景天>狭叶红景天>长鞭红景天，两两比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.001），详见图2（注：“*”为P<0.05，“**”为P<0.01，“***”为P<0.001）。

3 讨论

本研究建立了采用HPLC法同时测定大花红景天、狭叶红景天及长鞭红景天药材中没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸含量的方法，该方法简便可行，可为其质量控制提供参考。单因素方差分析和Tukeys多重比较结果显示，大花红景天、狭叶红景天及长鞭红景天中5种化学成分含量存在显著差异，大花红景天中没食子酸、红景天苷、酪醇和咖啡酸含量均显著高于长鞭红景天，大花红景天中的红景天苷、咖啡酸含量均显著高于狭叶红景天。

同一品种红景天药材不同产地的化学成分含量也存在较大差异，如四川省甘孜州白玉县（S28）及德格县（S29）所产狭叶红景天中红景天苷含量明显高于其他批次，说明产地对药材质量具有重要影响。另外，长鞭红景天中红景天苷的含量普遍很低，若临床应用中出现品种混用的情况，其疗效难以得到保证。

笔者参考相关文献[15]，考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液等流动相体系，发现以乙腈-0.3%磷酸溶液为流动相（梯度洗脱）时的色谱峰分离效果良好，故选择此流动相体系。此外，通过对不同检测波长（230、275、308、330 nm）、不同柱温（20、25、30 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同色谱柱（ZORBAX SB-C18、WondaSil C18、CAPCELL PAK C18）進行比较，发现色谱柱为WondaSil C18，检测波长为275 mm，柱温为25 ℃，流速为1.0 mL/min时5种成分均能达到基线分离。

笔者又通过对不同提取方式（超声、冷浸、回流）、不同提取时间（15、30、45 min）、不同提取溶剂（50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、乙醇、70%甲醇溶液、甲醇）进行比较，发现以70%乙醇溶液超声处理30 min时5种成分的提取效果最好。

综上所述，本方法简便可行、结果准确，可用于同时测定大花红景天、狭叶红景天和长鞭红景天药材中没食子酸、红景天苷、酪醇、咖啡酸、对香豆酸的含量。3种常见红景天药材中的化学成分含量存在较大差异，尤以大花红景天中红景天苷的含量最高。

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（收稿日期：2018-03-28 修回日期：2018-06-18）

（编辑：陈 宏）