滇丹参与丹参有效成分含量的差异

田红彦， 飞进强， 邹 转， 徐绍忠

(云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)

0 引言

【研究意义】丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)为双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，始载于《神农本草经》，被列为上品[1]，是历版《中华人民共和国药典》收载中药丹参的唯一的基源植物。历版《中国药典》收载的丹参药材均来源于唇形科鼠尾草属植物丹参一种，实则全国作丹参入药还有白花丹参、南丹参、甘西鼠尾、褐毛甘西鼠尾和云南鼠尾草等[2]。滇丹参(SalviayunnanensisC. H. W. Wright)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)多年生草本植物，在《中国植物志》上又名云南鼠尾草、丹参、小丹参、紫丹参、山槟榔、小红参、小红党参、小红草乌、小槟榔、紫参、奔马草和朱砂理肺散等[3-5]。滇丹参与著名中药丹参同属，且具有与丹参相似的药理活性[6]，往往作为丹参的代用品使用[5-7]。滇丹参主要分布于云南、四川和贵州等地。滇丹参作为药用植物首载于《滇南本草》[8]，已有悠久的历史，《云南省药品标准》[9]也将其作为地方药材收录其中，其作用主要为活血调经、祛瘀生新、镇静止痛、除烦安神、活血通经、祛瘀止痛和清心除烦等疗效，主要用于治疗冠心病和心脑血管疾病等[10-13]，民间用于胸痹心痛等痛症，已有数百年历史。滇丹参在云南地区具有悠久的使用历史，分布广，资源丰富，具有较高的开发利用价值，但由于长期野生采挖，导致滇丹参的野生种群减少，野生资源濒临灭绝。目前，国产栽培丹参因长期采用无性繁殖，品种严重退化，商品质量和产量极不稳定，已成为国产丹参出口创汇和生产质量管理规范(GAP)研究的“瓶颈”[14]。而人工种植在一定程度能解决资源短缺，采用规范化的人工种植能在保证药效的前提下保护野生资源。【前人研究进展】药材有效成分含量的高低是衡量其品质最重要的标准。有效成分的确立决定了药材相关质量评价体系的确立[15]，多年来对于丹参类药材，多用丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参素和丹酚酸B等成分的含量评价其品质。高效液相色谱法(HPLC)是目前含量测定中成熟并常用的方法。周晓丽等[16]采用高效液相色谱法(HPLC)对本草文献记载的5个道地产区和3个非道地产区的丹参进行丹参素钠、丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量的测定，证明了文献记载的丹参道地产区的合理性，为道地药材的研究奠定基础。施天慧等[17]用高效液相法和紫外分光光度法对7种云南鼠尾草和1个变种的丹参酮类和丹酚酸类成分进行测定，为滇丹参和丹参的品质评价和资源利用提供了科学依据。【研究切入点】目前我国对滇丹参、丹参的研究主要集中在化学成分和药理活性方面，对种质资源的收集，引种驯化后化学含量之间关系的研究尚属空白。【拟解决的关键问题】采用高效液相色谱法对人工驯化后滇丹参与丹参有效成分含量进行测定，并比较二者的有效成分含量，为丹参杂交品种的亲本选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 丹参 滇丹参，来自云南蒙自地区；丹参，引种自河南。均由云南农业大学农学院中药材研究所提供。

1.1.2 试剂 乙腈磷酸色谱纯、甲醇色谱纯等，常规化学试剂均购(傲雪商贸，昆明)；标准品：丹参酮ⅡA(CHB160919)HPLC≥98%，丹参酮Ⅰ(CHB160922) HPLC≥98%，隐丹参酮(CHB180814) HPLC≥98%，丹酚酸B(CHB171015) HPLC≥98%，生产厂家克洛玛生物(成都)。

1.1.3 仪器 ZA100R3电子天平，上海赞维衡器有限公司生产；纯水机，ELGA LaBWater(U.K.)生产；Aglient1260高效液相色谱仪，安捷伦科技中国分公司生产。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

1) 丹参样品。对种植于云南农业大学试验地的生长12～15个月的滇丹参与丹参，采挖后考查植物性状后，烘干，打成粉末，过40目筛。根据产量性状(根鲜重)对122株滇丹参和25株丹参进行抽样，样品包括30份滇丹参和20份丹参(表1)。

表1 滇丹参与丹参高效液相抽样检测的样本

2) 丹参酮类含量标准储备液。精密称取隐丹参酮标准品1.07 mg、丹参酮Ⅰ标准品0.50 mg和丹参酮ⅡA标准品1.11 mg，分别装入100 mL容量瓶中，然后加入80%甲醇溶解，最终配置成终浓度为丹参酮Ⅰ0.012 5 mg/mL，隐丹参酮0.107 mg/mL，丹参酮ⅡA 0.166 5 mg/mL的储备液，保存于4℃冰箱备用。

3) 丹酚酸B标准储备液。精密称取丹酚酸B标准品1.07 mg，加入80%甲醇稀释定容，即配置成终浓度为1.07 mg/mL的储备液，保存于4℃冰箱备用。

4) 丹参酮类样品溶液制备。选取滇丹参高、中、低产，各抽样10份，丹参高、中产抽样各10份，共计50份样品。5份材料分别称取5 g研磨打粉，粉末过40目筛，精密称取0.06 g，置于10 mL容量瓶内，加入甲醇溶液溶解定容，超声波溶解30 min，静置30 min，1 mL注射器吸取上清液，用0.22 μm尼龙网滤膜过滤，装于上样瓶中，4℃冰箱保存备用。

5) 丹酚酸B样品溶液制备。选取滇丹参高、中、低产，各抽样10份，丹参高、中产抽样各10份共计50份样品。5份材料各称取5 g研磨打粉，粉末过40目筛，精密称取0.03 g，置于10 mL容量瓶内，加入80%的甲醇溶液溶解定容，超声波溶解30 min，静止30 min，1 mL注射器吸取上清液，用0.22 μm尼龙网滤膜过滤，装于上样瓶中，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 指标测定

1) 丹参酮类含量。色谱柱型号：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)色谱条件见表2。检测波长270 nm；柱温30℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。

表2 丹参酮类色谱条件

2) 丹酚酸B含量。色谱柱型号：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，色谱条件见表3。检测波长286 nm；柱温30℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

表3 丹酚酸B色谱条件

1.2.3 标准曲线绘制 精密吸取各标准品溶液0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL和5.0 μL进样，按确定的色谱条件进行分析，得到峰面积图，用Excel 2010以进样量的梯度为横坐标(x)，对应进样量的相对峰面积为纵坐标(Y)，构建线性回归方程。

2 结果与分析

2.1 丹参活性成分标准品的线性回归方程

从表4可知，丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹酚酸B的线性回归方程的R2均为1，表明，进样量(x)与检出峰面积(Y)存在良好线性关系。该检测方法对丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹酚酸B的测定范围分别为0.012 5～0.625 0 μg、0.010 7～0.535 0 μg、0.016 7～0.832 5 μg和0.107 0～5.350 0 μg。

表4 丹参活性成分标准品回归方程

2.2 丹参酮类的含量及其分布

2.2.1 丹参酮类的含量 从表5可知，滇丹参的丹参酮Ⅰ的含量为0.037 3%，略高于丹参(0.035 8%)，但二者没有显著性差异。丹参的隐丹参酮含量为0.035 6%，显著高于滇丹参(0.019 9%)。滇丹参的丹参酮ⅡA含量为0.137 5%，显著高于丹参(0.095 5%)。总体上，滇丹参的丹参酮总量(0.194 7%)略高于丹参(0.166 9%)，但二者无显著差异。参考2020版《中华人民共和国药典》“干燥品丹参中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA三者的总含量不得低于0.25%”的规定，滇丹参与丹参在丹参酮类含量上均未达到药典的规定。

表5 滇丹参与丹参的丹参酮类含量

2.2.2 丹参酮类含量的分布 检测结果表明，30株滇丹参的丹参酮类含量为0.03%～0.74%，其中，24株株的含量为集中在0.17%～0.31%，占测量总数的80%；丹参酮类含量≥0.25%的有8株，占测量总量的26.7%，其中含量最高的是DDS075号样本。20株丹参的丹参酮类含量为0.05%～0.35%，其中，17株样本的含量集中在0.13%～0.28%，占测量总数的85%；丹参酮类含量≥0.25%的有4株，占测量总量的20%，其中含量最高的DS021号样本。

2.3 丹酚酸B含量

20株丹参的丹酚酸B平均含量为5.49%，极显著高于滇丹参的丹酚酸B平均含量(3.17%)。2020版《中华人民共和国药典》中规定：干燥品丹参中丹酚酸B的含量不能低于3.0%。因此，总体看，滇丹参与丹参的丹酚酸B含量均达到药典的规定。从丹酚酸B含量分布看，30株滇丹参的丹酚酸B含量为1.78%～5.49%，其中25株样本的含量集中在2.52%～4.01%，占测量总数的83.3%；丹酚酸B含量≥3.0%的有21株，占测量总量的70.0%，其中DDS117号样本的含量最高。丹参中丹酚酸B含量为3.44%～8.68%，其中有18株样本的含量为4.75%～7.37%，占测量总数的90.0%；丹酚酸B含量≥3.0%的有20株，100.0%符合药典规定，其中DS05号样本的含量最高，其丹酚酸B含量为8.68%。

3 讨论

有效成分含量是否达标是对药用植物品质评价的重要标准。2020版《中华人民共和国药典》规定对丹参类药材水溶性化合物丹酚酸B的含量不低于3%，脂溶性化合物丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮三者的总含量不低于0.25%。在脂溶性含量方面，总体看，滇丹参与丹参(引种自河南)在丹参酮类含量上均未达到药典的规定。与飞进强等[18]的试验结果相似，即在露天环境条件下，滇丹参和丹参的丹参酮类化合物没达到药典标准。从丹参酮类含量分布看，30株滇丹参中丹参酮类含量≥0.25%的数量有8株，占测量总量的26.7%，其中含量最高的是DDS075号样本，其丹参酮类含量为0.74%；20株丹参中丹参酮类含量≥0.25%的数量有4株，占测量总量的20%，含量最高的DS021号样本，其丹参酮类含量为0.354%，同一水平下滇丹参材料合格率较高。在水溶性含量方面，丹参(引种自河南)的丹酚酸B含量极显著高于滇丹参。总体看，滇丹参与丹参在丹酚酸B含量均符合《中华人民共和国药典》2020版规定；30株滇丹参有21株的丹酚酸B含量≥3.0%，占测量总量的70.0%，其中含量最高的是DDS117号样本，其丹酚酸B含量为5.49%；而20株丹参的丹酚酸B含量全部≥3.0%，100.0%符合药典规定，其中含量最高的是DS05号样本，其丹酚酸B含量为8.68%。表明，同一水平下丹参材料的合格率高，品质好。

综合看，滇丹参与丹参在丹参酮类含量上均未达到《中华人民共和国药典》的规定，丹参在丹酚酸B含量方面显著优于滇丹参，与飞进强等[18-19]的结果差异较大，究其原因可能与人工驯化过程有一定关系，文凤娟等[19]采集的样本为纯野生的材料，飞进强等[18]所栽培的为野生扩繁种源，而该研究材料为野生资源结实种子播种栽培。

4 结论

滇丹参与丹参(引种自河南)的丹参酮类含量均未达到药典的规定；滇丹参单株达标率为26.7%，最高含量为0.74%；丹参单株达标率为20%，最高含量为0.354%。丹参的丹酚酸B含量极显著高于滇丹参。滇丹参与丹参的丹酚酸B含量均符合《中华人民共和国药典》2020版规定；滇丹参单株达标率为70.0%，最高含量为5.49%；丹参为100.0%合格，最高含量为8.68%，同水平下丹参材料合格率高，品质好。