多指标优选丹参提取工艺研究

2022-03-19闪媛媛张继斌孙代华陈志元

农产品加工 2022年3期

闪媛媛，王玉，徐浪，张继斌，孙代华，陈志元

（劲牌持正堂药业有限公司中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北黄石 435100）

0 引言

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，具有活血络祛瘀、通经止痛、凉血消痈、清心除烦等功效，是常用的中药组方药材[1]。2020 年版《中华人民共和国药典》（一部）要求以丹酚酸B 和丹参酮类包括丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ和隐丹参酮作为质量控制指标，说明丹酚酸B 和丹参酮类在丹参的药效中发挥重要作用[2]。现代药理学研究表明丹参在治疗心血管疾病、肝硬化、溃疡、新生儿缺氧性脑病等方面具有显著疗效[3-4]。丹酚酸B 是丹参酚酸类化合物中含量较高的代表性成分，对心脑血管疾病和肝脏疾病等具有较好的临床效用[5-8]。丹参酮类主要包括隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ，其中隐丹参酮是主要的抗癌活性成分，丹参酮ⅡA 具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性，丹参酮Ⅰ是丹参抑菌有效成分之一，且可以治疗痤疮和心绞痛，具有改善肺部炎症、保护神经等作用[9-13]。韩丽等人[14]使用动态减压法提取丹参中丹酚酸B。高扬等人[15]以热回流法提取丹参中的丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的。然而，关于丹酚酸B 和隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ等3 种丹参酮类同时提取的文献报道较少。试验以丹酚酸B 和丹参酮类（隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ三者之和）提取率为指标，通过单因素试验和正交试验确定最佳的提取工艺，以期为丹参药材的充分利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

丹参，临沂九州天润中药饮片产业有限公司提供；丹酚酸B 对照品、丹参酮IIA 对照品，中国食品药品检定研究院提供；乙腈、磷酸等试剂为色谱纯、甲醇、乙醇等试剂均为分析纯、纯净水（公司生产）；95%食用酒精。

1.2 仪器

6890 型气相色谱仪，安捷伦科技公司产品；AB135-S 型电子天平，梅特勒- 托利多公司产品；FA2004 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；SK8200LHC 型超声提取器，上海科导超声仪器有限公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司产品。

1.3 丹酚酸B 含量的检测

1.3.1 供试品溶液制备

精密量取丹参提取液样品1 mL 至10 mL 容量瓶中，加50%乙醇稀释并定容，0.22 μm 有机相针式过滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液备用。

1.3.2 对照品溶液制备

精密称取丹酚酸B 标准品适量至25 mL 容量瓶中，80%甲醇超声溶解并定容，混匀，配制成丹酚酸B 含量300 mg/L 左右的标准品溶液。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Waters T3 型色谱柱，流动相为乙腈∶0.1%磷酸= 25∶75，流速为1.2 mL/min，检测波长为286 nm，柱温为20 ℃。

1.3.4 丹酚酸B 含量测定

对照品溶液与供试品溶液进样体积均为10 μL，注入液相色谱仪测定。以丹酚酸B 对照品保留时间定性，以标准溶液浓度和色谱峰面积建立标准曲线，计算样品中相应的色谱峰面积，带入标准曲线得到供试品溶液中丹酚酸B 的浓度，再乘以稀释倍数即可得到丹参提取液中丹酚酸B 的含量，计算结果保留到小数点后2 位数字。

1.4 丹酚酮类含量的检测

1.4.1 供试品溶液制备

精密量取丹参提取液样品1mL 至10mL 容量瓶中，加50%乙醇稀释并定容，0.22 μm 有机相针式过滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液备用。

1.4.2 对照品溶液制备

取丹参酮ⅡA 对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含20 mg 的溶液，备用。

1.4.3 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-Aq 型C18色谱柱，以乙腈为流动相A ，以0.02% 磷酸溶液为流动相B ，梯度洗脱程序如下：0～6 min 61% （A）、6～20 min 61%→90%（A）、20～20.5 min 90%→61%（A）、20.5～25 min 61%（A），流速为1 mL/min，柱温为20 ℃，检测波长为270 nm。

1.4.4 丹参酮类测定

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定。以丹参酮ⅡA 对照品为参照，以其相应的峰为S 峰，计算隐丹参酮、丹参酮I 的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%范围之内。

相对保留时间和校正因子见表1。

表1 相对保留时间和校正因子

以丹参酮ⅡA 的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA 的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 因素水平表

影响丹参药材提取的因素主要有提取温度、提取时间、溶剂倍数、提取溶剂等。

单因素试验因素与水平设计见表2。

表2 单因素试验因素与水平设计

2.1.2 提取温度对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，分别加入50%乙醇300 mL，在50，60，70，80，90 ℃等不同温度条件下，提取2 次，每次提取1.0 h，收集提取液，按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同温度下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表3。

表3 不同温度下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

由表3 可知，随着提取温度的增加丹酚酸B 的提取率呈增加趋势，分析原因为高温条件下更有利于丹酚酸B 的溶出，且在提取的短时间内丹酚酸B未发生分解。但温度对丹参酮类提取率几乎无影响。

2.1.3 提取溶剂对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，分别加入300 mL 20%，35%，50%，60%，70%等不同体积分数的乙醇溶液，在60 ℃条件下，提取1.0 h，提取2 次，收集提取液。按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同乙醇体积分数下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表4。

表4 不同乙醇体积分数下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

由表4 可知，不同乙醇体积分数对丹酚酸B 和丹参酮类的提取率影响不同。随着乙醇体积分数的增加，丹酚酸B 的提取率先增加后降低，变化的幅度不大，乙醇体积分数为60%时，提取率最高。丹参酮类提取率随着乙醇体积分数的增加显著增加，乙醇体积分数为70%，提取率最高。

2.1.4 提取时间对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，加入50%乙醇300 mL，提取2 次，提取温度为60 ℃，提取时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，收集提取液。按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同提取时间下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表5。

表5 不同提取时间下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

由表5 可知，随着提取时间延长，丹酚酸B 和丹参酮类的提取率均是先增加后降低，提取时间为1.5～2.0 h 时，提取率较高。

2.1.5 溶剂倍数对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，分别加入50%乙醇200 mL（4 BV），300 mL（6 BV），400 mL（8 BV），500 mL（10 BV），600 mL（12 BV），在60 ℃条件下，热提取1.0 h，提取2 次，收集提取液。按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同溶剂倍数条件下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表6。

由表6 可知，随着溶剂倍数的增加，丹酚酸B和丹参酮类的提取率均呈现上升趋势，在溶剂倍数增加至6 BV 后，再增加溶剂倍数，丹酚酸B 和丹参酮类提取率提升的幅度有限。

表6 不同溶剂倍数条件下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，正交试验设计以提取温度、溶剂体积分数、提取时间、溶剂倍数为考查因素，设计四因素三水平正交试验。称取50 g 丹参药材，按照正交试验设计表进行提取试验，提取2 次，提取结束后合并提取液，量取各提取液体积，按规定的检测方法测定丹酚酸B 和丹参酮类含量。

因素与水平设计见表7，直观分析见表8。

表7 因素与水平设计

由表8 可知，影响丹酚酸B 提取率大小的因素依次是提取温度（A） >溶剂体积分数（B） >提取时间（C） > 溶剂倍数（D），最佳提取条件为A3B1C3D1。丹参酮类提取因素影响大小依次为溶剂体积分数（B） >提取时间（C） >提取温度（A） >溶剂倍数（D），最佳提取条件为A1B2C3D3。综合丹酚酸B 和丹参酮类的提取率，并以各自提取率的1/2加和之后的提取率作为最终的选择依据，得出最佳提取条件为提取溶剂70%乙醇，提取温度80 ℃，每次提取2 h，溶剂倍数为6 BV。

表8 直观分析

2.3 正交试验验证和提取次数的优化

按正交试验得到的工艺条件，对提取次数进行优化和正交工艺验证。分别称取丹参饮片药材50 g的样品3 份，前2 次提取液和第3 次提取液分开收集，分别检测丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

提取次数优化和正交验证试验结果见表9。

由表9 可知，第3 次提取丹酚酸B 和丹参酮类提取率的提取率平均值分别为11.5%和5.99%，需进行第3 次提取。3 组验证试验丹酚酸B 和丹参酮类的提取率平均值分别为82.40%和92.67%，已基本提取完全。

表9 提取次数优化和正交验证试验结果

2.4 温度对丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的稳定性影响

考虑丹酚酸B 和丹参酮类化合物对温度和加热时间的敏感性，开展丹参提取液在不同温度和不同加热时长下的稳定性考查，进一步验证提取工艺的合理性。准确吸取丹参中试第一批提取液5 mL 于试管中，共7 份，取一支做空白对照，其余6 支均分后分别置于65 ℃和80 ℃水浴中保温，连续加热8 h，分别在2，4，8 h 取出一支试管，自来水迅速冷却，转移到10 mL 容量瓶中定容，检测丹酚酸B和丹参酮类质量浓度，计算其降解率。

温度对丹酚酸B 和丹参酮类的影响数据见表10。

表10 温度对丹酚酸B 和丹参酮类的影响数据

由表10 可知，丹参提取液分别在65 ℃和80 ℃下恒温加热8 h，相同加热时间下，低温65 ℃条件下丹酚酸B 和丹参酮类的降解率略小于高温80℃，但2 种温度条件下丹酚酸B 和丹参酮类的质量浓度变化很小，由此可以说明短时间内，65 ℃和80 ℃恒温加热对丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的稳定性没有影响，此提取工艺中的提取温度和提取时间参数合理。