UPLC-MS/MS法同时测定采后莲雾果实中7 种酚酸类物质含量

尹青春，张容鹄，吴 广，王承业，段宙位，谢 辉，邓 浩,

（1.海南省农业科学院农产品加工设计研究所，海南省热带果蔬冷链研究重点实验室，海南 海口 570100；2.海南省食品检验检测中心，国家市场监管重点实验室（热带果蔬质量与安全），海南 海口 570314）

莲雾（[Blume]Merrill &L.M.Perry）又名洋蒲桃、甜雾等，原产于马来半岛，我国台湾省最早引入。目前，中国台湾、广东、海南、广西、福建、云南、贵州和四川等地均有栽培。莲雾果实清甜、肉质饱满、水分含量高，具有较高的营养价值，富含蛋白质、膳食纤维、糖类、维生素、黄酮和酚酸等。但是，莲雾果实采后呼吸代谢十分旺盛，果肉易木质化而出现絮状绵软症状，造成品质劣变而失去商业价值。酚酸类物质是指同一苯环上有若干个酚性羟基的一类化合物。酚酸类物质在多种酶催化作用下，通过苯丙烷代谢途径生成木质素。酚酸类物质包括没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、水杨酸等。它们具有抗氧化、清除自由基、抑菌等生物活性，在保健品和医药上用途广泛。

酚酸类物质是一组复杂多样的二级植物代谢物，是木质素合成的重要中间产物，分为游离和结合方式存在于水果中。现有的文献报道，多以有机溶剂直接萃取，忽略水果中以结合方式存在的酚酸类物质，造成定量不够准确。酚酸类物质的批量分析是开展莲雾木质素代谢和絮状品质劣变研究的基础。目前，水果中酚酸类物质的批量检测方法有液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-串联质谱法等。气相色谱-质谱需要对样品进行衍生化，酚酸类物质极性强、活性高，长时间衍生处理会损失而引起较大误差。超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法灵敏度高，不需要衍生，分析时间短，已用于甜樱桃、梨等水果中用于酚酸类物质含量的检测。关于莲雾果实中木质素代谢途径中多种关键酚酸类物质的UPLC-MS/MS检测方法鲜有报道。本研究使用超声提取方式，优化样品提取液、提取次数等参数，能有效提取莲雾果实中2 种形式存在的酚酸类物质。建立的UPLCMS/MS方法用于检测采后莲雾果实中7 种关键酚酸类物质含量，并构建综合评价模型，旨在为采后莲雾果实品质研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑金刚莲雾购于海口市南北水果批发市场。

没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸（纯度≥98%） 中国食品药品检定研究院；水杨酸（纯度≥99.8%） 美国First Standard公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙醇（均为色谱纯） 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

4500 三重四极杆质谱仪 美国AB 公司；Ultimate 3000超高效液相色谱仪 美国Thermo公司；Centrifuge 5804 R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；多管涡旋混合器 德国Heidolph公司；Mettler XS204分析天平 美国Mettler Toledo公司；SCIENTZ-950E 超声波提取器 宁波新芝生物科技公司；WBL2501B果蔬搅拌机 美的集团股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准工作溶液的配制

称取没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、水杨酸10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成质量浓度约为1.0 mg/mL标准储备溶液；量取适量7 种酚酸类物质的标准储备溶液，配制成质量浓度1 000 ng/mL混合标准使用溶液，置于-18 ℃冰箱冷藏保存。

1.3.2 样品前处理

取15 个大小相近的果，每5 个为一组，共3 组。将5 个莲雾用果蔬搅拌机处理2 min，称取经搅拌均匀的试样5.0 g，加入5 mL纯水和30 mL乙腈，加入2 粒陶瓷均质子，旋涡10 min，超声10 min，10 000 r/min离心5 min；取上清液至旋转蒸发瓶中。用30 mL乙腈重复提取1 次，合并上清液至旋转蒸发瓶中，于45 ℃旋转蒸近干，用10%乙腈溶液（含0.2%甲酸）溶解残渣，并定容至10 mL，过0.22 μm有机滤膜，上机测定。3 组平行样品，经检测后计算平均值。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：CORTECST3（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相A：0.2%甲酸溶液；流动相B：乙腈；柱温30 ℃；进样量5.0 μL，流速0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～2 min，95% A，5% B；2～5 min，95%～70% A，5%～30% B；5～9.5 min，70%～10% A，30%～90% B；9.5～10 min，10%～95% A，90%～5% B；10～15 min，95% A，5% B。

质谱：电子电离源，负离子模式；扫描模式：选择反应监测模式；喷雾电压-4 500 kV；离子源温度550 ℃；雾化气压力50 psi；加热气压力50 psi；气帘气压力25 psi；碰撞室入口电压-10 V。优化后7 种酚酸类物质的质谱参数见表1。

表1 7 种酚酸类物质的质谱参数Table 1 MS parameters of seven phenolic acids

1.3.4 莲雾采后贮藏及检测

莲雾采后于20 ℃贮藏，每间隔2 d用所建立的UPLCMS/MS方法检测酚酸类物质。每次取15 个果分为3 组，每组5 个果按1.3.2节方法进行前处理，重复检测3 次，取平均值。

1.4 数据处理

每个样品重复测量3 次，实验数据采用SPASS 22.0软件进行统计分析，用OriginPro 2019b进行绘图。

2 结果与分析

2.1 色谱柱及流动相的筛选

对比Waters CORTECST3（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Phenomenex KinetexC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Agilent Eclipse Plus C（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3 款色谱柱对7 种酚酸类物质的分离效果。经对比，由于没食子酸与C柱键合度差，造成其在C柱上保留时间较短，使没食子酸的响应较差，峰形有拖尾现象。C柱对7 种酚酸类物质的响应不及T3柱；T3色谱柱的目标化合物总离子色谱图如图1所示，其分离效果及响应最好。马帅等同样采用T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）测定花椰菜和西兰花样品中23 种酚酸类物质，分离效果较好，这和本实验结果一致。因此，选择Waters CORTECST3色谱柱进行后续UPLC-MS/MS参数优化。

图1 Waters CORTECS® T3总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of seven phenolic acids separated on T3 column

对比0.1%甲酸-甲醇、10 mmol/L乙酸铵-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、10 mmol/L乙酸铵-乙腈4 种不同流动相体系对7 种酚酸类物质的分离及响应效果。结果表明，2 种含乙腈的流动相对大部分酚酸类物质的分离效果及色谱峰形均较好。同时，流动相体系中添加一定量的甲酸或乙酸，能够减少酚酸类物质发生电离，减少色谱峰形拖尾变宽且不对称的情况。经综合对比，0.1%甲酸-乙腈的色谱峰形、信号响应、稳定性最优。据文献报道，采用乙酸-甲醇、乙酸-乙腈、甲酸-甲醇、甲酸-乙腈作为流动相进行酚酸类物质的检测，在不同仪器不同色谱柱上表现均较好。这和本实验结果一致。

2.2 样品提取液及提取次数的筛选

分别将30 mL甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、正己烷与5 mL水混合作为提取液，对比了7 种酚酸类物质的提取效果。如图2所示，使用正己烷-水作提取液无回收率，表现最差。说明7 种酚酸类物质在正己烷-水中溶解度最差，不适合作为提取液。乙酸乙酯-水作提取液对绿原酸回收率仅为65.3%，乙腈-水对7 种酚酸类物质的整体提取效果最好，回收率为85.7%～121.4%。张峰等采用60%甲醇-水提取大蒜中16 种多酚类物质，回收率为80%～120%，但没食子酸、绿原酸、咖啡酸、水杨酸均未检出。因此，选择乙腈-水作为提取液。

图2 样品提取液对7 种酚酸类物质回收率的影响Fig.2 Effect of extraction solvents on the recoveries of seven phenolic acids

按照1.3.2节对样品进行前处理，并采用乙腈-水分别对样品提取1、2、3 次，以回收率评价提取效果。结果如图3所示，乙腈-水对莲雾中酚酸类物质提取3 次后，没食子酸和咖啡酸的回收率分别提高至108.9%、109.5%。提取2 次各酚酸类物质的回收率更接近100%，且提取次数过多还会增加误差和杂质的干扰风险。因此，为减少误差，提高提取工作效率，选择提取2 次。

图3 提取次数对7 种酚酸类物质回收率的影响Fig.3 Effect of number of extraction cycles on the recoveries of seven phenolic acids

2.3 线性范围、检出限、定量限、精密度、平均回收率结果

采用优化好的UPLC-MS/MS参数进行方法学研究。以7 种酚酸类物质的质量浓度（）为横坐标，峰面积（）为纵坐标，建立标准曲线，如表2所示，7 种酚酸类物质均呈现良好的线性关系，线性范围为5.0～1 000 ng/mL，相关系数不小于0.996 1。以信噪比不小于3计算检出限，没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、水杨酸的检出限分别为0.3、0.6、1.8、2.7、0.3、1.2、0.3 μg/kg；以信噪比不小于10计算定量限，定量限分别为1.0、2.0、5.0、5.0、1.0、5.0、1.0 μg/kg。

表2 7 种酚酸类物质的线性关系、检出限、定量限、回收率Table 2 Linear equations,limits of detection and quantification,and recoveries of seven phenolic acids

NY/T 3290—2018《水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的测定 液质联用法》中HPLC-MS/MS法对没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、水杨酸检出限分别为26、25、19、34、27、38、36 μg/kg。本方法检出限均低于此标准，说明本检测方法灵敏度较高。对质量浓度为100.0 ng/mL的7 种酚酸类物质的标准溶液重复测定6 次，该方法的相对标准偏差（=6）为1.9%～7.5%，说明仪器具有良好的精密度。将7 种目标化合物添加到空白莲雾样品中，进行50、100、200 μg/kg 3 个水平的添加回收实验，每个水平取6 个平行样，3 个水平的各酚酸类物质平均回收率为93.6%～98.8%，说明本方法回收率较好。

2.4 采后莲雾果实中7 种酚酸类物质含量的检测

通过本研究建立的UPLC-MS/MS方法对采后莲雾果实中7 种酚酸类物质含量进行测定。本方法未检出绿原酸。其他6 种酚酸类物质含量如表3所示。第0天，莲雾果实中酚酸类物质含量为没食子酸＞香草酸＞水杨酸＞阿魏酸＞异阿魏酸＞咖啡酸。在采后贮藏0～4 d内，莲雾果实中的没食子酸、水杨酸含量随着贮藏时间的延长而增加，在贮藏第4天达到最高值，贮藏4 d后则下降。莲雾果实中的阿魏酸含量在采后贮藏0～6 d内增加，在贮藏第6天达到最高值，贮藏6 d后则下降。上述结果与王斌和Elmastaş等在其他水果上的检测结果类似。异阿魏酸在贮藏期间，持续增加。咖啡酸和香草酸呈现波动式变化的趋势。大量研究表明，酚酸类物质因具有抗氧化活性，能清除果实贮藏期间产生的自由基。因此，7 种酚酸在贮藏期间动态变化推测可能与自由基清除有关。

表3 莲雾中酚酸类物质在贮藏中的变化Table 3 Contents of phenolic acids in wax apple fruit during storage

2.5 酚酸类化合物主成分分析（principal component analysis，PCA）

PCA用于综合评价6 种酚酸类物质在莲雾果实贮藏过程中的变化。如图4所示，6 个酚酸类物质指标共得到3 个PC：PC1特征值为2.72，贡献率为45.3%；PC2特征值为1.45，贡献率为25.0%；PC3特征值为1.16，贡献率为19.4%。3 个PC累计贡献率达89.7%，可以共同代表6 种酚酸类物质的含量及变化趋势。将各酚酸类物质含量进行标准化处理，以所占总贡献率的比例、、为权数，构建3 种PC的综合评价模型：

图4 酚酸类物质PCA图Fig.4 PCA plot of six phenolic acids

=×+×+×

=0.564+0.563+0.511+0.120-0.298+0.563

=0.06+0.130-0.011+0.743+0.639+0.130

=0.251-0.264+0.087-0.183+0.045-0.026

=（45.3/89.7）+（25.0/89.7）+（19.4/89.7）

由表4可知，和主要表现的是由“低-高-低”变化的酚酸类物质；主要表现的是由“低-高-低-高”波动式变化的酚酸类物质；综合得分值是对3 个PC的总结性归纳，表现为“低-高-低”变化趋势，值在贮藏第6天出现负值，说明其酚酸类物质已经开始大量分解。酚酸类物质因其具备抗氧化活性，与果实酶促褐变、品质劣变都有着密切的联系。因此，经过6 d贮藏，伴随着酚酸类物质的大量分解，推测莲雾的品质可能已发生了明显变化。

表4 莲雾果实中酚酸类物质含量标准化值与综合得分Table 4 Standardized values and comprehensive scores of phenolic acid contents in wax apple fruit

3 结论

建立同时测定莲雾果实中7 种酚酸类物质的UPLCMS/MS方法。7 种酚酸类物质在5.0～1 000 ng/mL范围呈良好的线性关系，相关系数不小于0.996 1，加标回收率为93.6%～98.8%，相对标准偏差为1.9%～7.5%，检出限为0.3～2.7 μg/kg，定量限为1.0～5.0 μg/kg。使用该方法，对贮藏10 d期间的莲雾果实中酚酸类物质进行分析，验证其可靠性。经PCA获得了3 个PC和相应数学评价模型。发现采后第6天，莲雾果实中酚酸类物质大量分解。该方法前处理简单，灵敏度高，可为莲雾果实采后酚酸物质检测提供参考。