玉米ZmGly2基因的生物学功能与表达特性

王春晓， 李 楠， 裴玉贺， 于秋鸿， 宋希云， 李 军

(青岛农业大学 农学院, 山东 青岛 266109)

0 引言

【研究意义】近年来，作物生长季频繁发生的高温热害已成为全球重大自然灾害之一[1]。研究发现，21世纪的全球地表平均气温比20世纪升高1.4～5.8℃，且温度每升高1℃，玉米将减产10%～20%[2]，高温期间往往伴随干旱，给玉米生产造成的危害更加严重[3]。【前人研究进展】WANG等[4]研究发现，玉米幼苗在遭受热激处理时体内会积累大量的甲基乙二醛(MG)。MG是一类有毒的醛酮类代谢物，对多种细胞成分具有高度反应活性，导致其不可逆地修饰进而形成加合物和交联[5]。MG的降解途径有2条：一是依赖GSH(还原型谷胱甘肽)的途径，包括乙二醛酶1(GLY1)和乙二醛酶2(GLY2)；二是不依赖GSH的途径，如乙二醛酶3(GLY3)。乙二醛酶在动物细胞中研究得比较清楚，参与细胞增殖、胚胎发生、成熟和细胞死亡等生物过程[6-7]。植物乙二醛酶系统首次在花旗松针中报道[8]，之后在单、双子叶植物中均有报道[9-14]。ZmGly2编码产物是羟酰谷胱甘肽水解酶，参与MG降解的第二步反应[15]。过表达Gly1和Gly2的转基因烟草、水稻和拟南芥均表现出较强的耐盐和抗旱能力[16-18]。【研究切入点】然而，迄今对玉米ZmGly2的表达特性和生物学功能还缺乏深入的研究。【拟解决的关键问题】为此，利用生物信息学和qRT-PCR方法的方法对ZmGly2蛋白的结构、理化性质和表达差异等进行分析，找出该基因在干旱、高温胁迫应答中的可能作用，为将来通过CRISPR-Cas9基因编辑技术培育抗旱耐热玉米新种质提供可利用的基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物 玉米品种为郑单958，购自河南金博士种业股份有限公司。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂盒购自Takara公司，反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，引物由上海派森诺生物科技股份有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR用引物

1.2 玉米根茎叶的获取

将玉米种子播于含有营养土和蛭石(3∶1)的花盆(1粒/盆)中，置于青岛农业大学智能温室内(25℃)生长。待幼苗长至三叶期时分别进行干旱(20% PEG600)和高温(37℃)处理，在处理0 h、12 h、24 h、36及48 h后选取玉米的根、茎和叶，快速置于液氮中保存备用。每个处理含5棵幼苗， 3次重复。

1.3 生物信息学分析

根据文献[15]，从NCBI网站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)检索到ZmGly2(登录号：XM_008652743)；利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)分析ZmGly2编码蛋白的理化性质；使用TMHMM Server 2.0进行蛋白跨膜结构预测；利用SWISS-MODEL进行蛋白质高级结构分析；利用MEGA 7.0对ZmGly2进行系统进化树分析。

1.4 总RNA提取、cDNA合成及表达模式分析

利用RNA提取试剂盒说明提取总RNA；按照反转录试剂盒说明合成cDNA；用qRT-PCR分析表达模式，以玉米Actin作为内参基因。

2 结果与分析

2.1 ZmGly2蛋白的理化性质

经分析发现，ZmGly2基因的cDNA序列为1 014 bp，编码337个氨基酸，理论分子量为34.4 KD，等电点为7.66。对氨基酸组成分析发现，带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)残基总数为32个，带正电荷的氨基酸(Arg + Lys)残基总数为33个，Leu含量最高，占10.6%；Trp含量最少；占0.6%。蛋白不稳定系数较低，为35.9，属于稳定蛋白。疏水性较低，为-0.279，表明其为亲水性蛋白。利用NCBI数据库中的CD-Search分析发现，ZmGly2蛋白有2个结构域，一是N端的金属-β-内酰胺酶结构域；二是C端的羟酰谷胱甘肽水解酶结构域(图1a)。经TMHMM Server分析，该蛋白不含跨膜结构域，可能为细胞质蛋白(图1b)。

图1 ZmGly2蛋白保守区分析(a)和跨膜结构域预测(b)

2.2 ZmGly2蛋白的结构

ZmGly2蛋白的空间结构有Fe2+和Zn2+2个金属结合位点(图2)。其中，Fe2+的结合位点在His252、His142、Asp141和Asp241处，Zn2+的结合位点在His137、His139、His195和Asp214处，说明ZmGly2蛋白是一种金属酶。

图2 ZmGly2蛋白质空间结构模型(a)和金属结合位点(b)

2.3 ZmGly2蛋白的系统进化树

从NCBI数据库中检索到与ZmGly2蛋白同源的其他植物氨基酸序列，选取氨基酸序列同源性≥60%的13种植物进行进化树分析表明，ZmGly2蛋白与南荻MlGly2同源性为97.11%，亲缘关系最近；与三裂叶薯ItGly2同源性为67.54%，亲缘关系最远(图3)。

注：TuGly2为乌拉尔图小麦；MlGly2为南荻；ZmGly2为玉米；SbGly2为高粱；PhGly2为黍；PvGly2为柳枝稷；SvGly2为狗尾草；DeGly2为福尼奥小米；EcGly2为弯叶画眉草；ObGly2为短花药野生稻；PdGly2为海枣；CsGly2为亚麻荠；ItGly2为三裂叶薯；McGly2为博落回。

2.5 ZmGly2基因的组织特异性表达

如图4所示，ZmGly2基因在叶片中的相对表达量最高，茎次之，根中最低。ZmGly2基因在叶中的表达量分别是根和茎中表达量的8.1倍和5.3倍。

图4 ZmGly2在不同组织的相对表达量

2.6 ZmGly2基因在高温和干旱逆境胁迫下的表达量

如图5所示，ZmGly2基因对高温和干旱胁迫应答呈现出先升高后降低的趋势。ZmGly2基因在高温处理24 h后表达量达最高，是处理前的3.5倍，在处理48 h后其相对表达量略有降低，是处理前的2.0倍。ZmGly2基因在干旱处理36 h后表达量达最高，是处理前的5.9倍，在处理48 h后其相对表达量降低，约是处理前的1.8倍。

注：**表 示差异达极显著(P<0.01)水平。

3 讨论

在干旱、热害等逆境胁迫条件下，植物细胞内会积累大量的有毒物质如甲基乙二醛(MG)等，乙二醛酶系统在清除过量MG、维持其在细胞内的动态平衡中发挥重要作用[19]。在依赖GSH的降解途径中，乙二醛酶Ⅰ(GLYⅠ)和乙二醛酶Ⅱ(GLYⅡ)协同作用，以GSH为辅因子，将MG降解为无毒的乳酸。研究发现，Gly1是一类依赖金属离子如Ni2+或Zn2+的蛋白酶[20]。利用生物信息学的方法分析玉米Gly2蛋白(ZmGly2)的理化性质和结构特点发现，ZmGly2含有337个氨基酸，分子量为34.41 KD，为稳定的亲水性蛋白。由于该蛋白缺乏跨膜结构，猜测ZmGly2可能定位于细胞质中。结构域分析发现，ZmGly2的N端为金属-β-内酰胺酶结构域，而C端为羟酰谷胱甘肽水解酶结构域。对13种植物的Gly2蛋白氨基酸同源序列分析发现，ZmGly2与南荻MlGly2同源性为97.11%，亲缘关系最近；与Gly1相类似，也是一种金属酶，含有Fe2+和Zn2+2个结合位点。

已有证据表明，Gly2基因参与了植物对逆境胁迫的应答。MUDALKAR等[21]发现，麻风树(JatrophacarcasL.)具有较强的抗旱和耐盐能力，与其自身存在较高的乙二醛酶活性有关。NAHAR等[22]研究，多胺处理绿豆幼苗发现，幼苗中乙二醛酶2的活性显著增加且耐盐能力明显提高。YADAV等[23]发现，高温和低温均诱导水稻Gly2基因的表达，导致内源MG含量降低，耐受温度胁迫的能力加强。ZmGly2基因在不同组织器官中的表达水平存在很大差异，在叶片中的表达量最高，且相对表达量受干旱和高温的强烈诱导，表现出先升高后降低的趋势，与YADAV等[23]结果一致。

4 结论

ZmGly2为含有Fe2+和Zn2+2个金属结合位点的非跨膜金属酶，且含有N端的金属-β-内酰胺酶结构域和C端的羟酰谷胱甘肽水解酶结构域，与南荻MlGly2的亲缘关系最近。且ZmGly2在叶片中的表达受高温和干旱的强烈诱导，参与玉米对干旱和高温的胁迫应答，为下阶段利用CRISPR-Cas9基因编辑技术深入解析其生物学功能奠定了基础。