虎耳草总黄酮含量测定及其抗氧化性
2022-03-09文培华颜怡冰王文君张岩向灿辉
文培华，颜怡冰，王文君，张岩，向灿辉
遵义医科大学珠海校区生物工程系（珠海 519041）
虎耳草（Saxifraga stoloniferaCurt）为虎耳草科多年生草本植物，全草入药，性寒、微苦、辛，有小毒，归肺、脾、大肠经，具有祛风清热、凉血解毒的功效。民间主要用于治疗风疹、湿疹、外伤出血、丹毒、痔疾、中耳炎、咳嗽等疾病[1-3]。虎耳草在我国不仅种类丰富（203种）[4]，且分布广泛，遍布华东、中南、西南南部及陕西等地，目前虎耳草的研究主要集中在虎耳草的栽培种植、植物基因组分析及其化学成分鉴定，虎耳草已鉴定出黄酮类、萜类、酚酸类及异香豆精类化合物等20余种，不同产地的虎耳草在成分种类、数量、含量上有共通性，也存在差异性，槲皮素、岩白菜素为虎耳草的代表性有效成分[5-7]。现代研究表明虎耳草提取物槲皮素、岩白菜素具有抗肿瘤作用[5-8]，也有研究表明虎耳草提取物具有抗菌、护肝和抗氧化作用，对羟基自由基表现出较高的清除能力[9-10]，但只是对粗提物的抗氧化能力进行了分析。因此，此次试验将深入研究虎耳草不同极性部位的抗氧化作用及其与黄酮含量的相关性，深入研究虎耳草活性部位及活性成分，为综合利用和深度开发药用植物虎耳草提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
虎耳草：购自安徽，经遵义医科大学陈阳教授鉴定。
对照品：DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）、ABTS（2,2’-联氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺）二氨盐）、芦丁、VC，购自合肥博美生物公司；其他试剂均为国产分析纯。
UV-2600紫外-可见分光光度计（日本岛津）；超声波清洗仪（上海同天生物技术股份有限公司）；旋转蒸发仪（Hei-VAP，德国Heidolph公司）
1.2 试验步骤
1.2.1 制备虎耳草不同极性部位样品
虎耳草全草，清除杂草，干燥，剪成碎段，粉碎至粗粉，过0.250 mm筛，称取500 g粗粉，以料液比1∶3（g/mL）加入80%的乙醇进行超声提取1 h，置夜，抽滤，滤渣再以料液比1∶1（g/mL）加入80%乙醇，超声1 h，抽滤，滤渣再以料液比1∶1（g/mL）提取1次，抽滤。合并3次滤液，减压旋蒸至无溶剂滴出，得到虎耳草黏稠浸膏，编号为样品1。
留取少量样品1，其余浸膏以料液比1∶5（g/mL）加入蒸馏水得到虎耳草浸膏溶液，然后向溶液中加入1∶1（g/mL）体积比的石油醚溶剂，充分混合萃取，分出石油醚层，再重复萃取两次，合并萃取液，减压旋蒸，得到石油醚萃取物浸膏，称为样品2；继续向水溶液中分别加入1∶1（g/mL）体积比的乙酸乙酯、正丁醇溶剂，进行同样的操作，得到乙酸乙酯萃取物浸膏和正丁醇萃取物浸膏，称为样品3和样品4；剩余的水溶液减压旋蒸得到水提物浸膏，称为样品5。
1.2.2 DPPH抗氧化性测定
1.2.2.1 试剂制备
DPPH试剂：准确称取12.50 mg的DPPH标准品，用无水乙醇溶解定容至250.00 mL，得到质量浓度为0.050 mg/mL的DPPH标准溶液，使用前进行适当稀释，使吸光度为0.70±0.05，作为使用液。
1.2.2.2 样品溶液制备
称取一定量的对照品VC、样品1～4浸膏，用无水乙醇溶解定容。样品5浸膏用DMSO溶解定容。然后每个样品均制备成5个质量浓度梯度的样品溶液，见表1。
表1 虎耳草样品和VC样品溶液制备
1.2.2.3 抗氧化性测定[11]
准确移取3.90 mL DPPH使用液，分别加入100 μL表1中各样品溶液，显色30 min，无水乙醇为空白对照，在517 nm波长下测定各样液的吸光度A。同时，以100 μL无水乙醇代替样品在相同的条件下进行测定，吸光度记为A0。平行测定3次，绘制清除率曲线，按式（1）计算半抑制率IC50值。
式中：A0为DPPH的初始吸光度；A为加入样品溶液后DPPH的吸光度。
1.2.3 ABTS+抗氧化性测定
1.2.3.1 试剂制备
精密称取96.33 mg的ABTS药品，即（Mr=548.68），同时称取16.56 mg的K2S2O8（过硫酸钾Mr=270.32）固体颗粒，分别用超纯水溶解定容至25.00 mL，配制成7.00 mmol/L的ABTS水溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液，按体积比1∶1（mL/mL）混合，在室温、避光的环境下混合12 h以上，即得浓度为3.5 mmol/L的ABTS+工作液。试验前用无水乙醇稀释约50倍，得到ABTS+使用液，吸光度为0.70±0.05。
1.2.3.2 样品溶液制备
称取一定量的对照品VC、样品1～4浸膏，用无水乙醇溶解定容。样品5浸膏用DMSO溶解定容。然后每个样品均制备成5个质量浓度梯度的样品溶液，见表2。1.2.3.3 抗氧化性测定[11]
吸取100 μL表2中各样品溶液，再向其中加入3.00 mL的ABTS+使用液，振荡，室温条件下避光反应30 min，在750 nm波长下测定吸光度A。同时，以100 μL的甲醇代替样品溶液，在相同条件下进行测定，吸光度为A0，绘制清除率曲线，按式（2）计算IC50值。
表2 虎耳草样品和VC样品溶液制备
式中：A0为ABTS+的初始吸光度，A为加入样品溶液后ABTS+的吸光度。
1.2.4 虎耳草样品中总黄酮含量测定
1.2.4.1 溶液制备
称取30.0 mg的芦丁标准品，用无水乙醇溶解定容至100.00 mL，质量浓度为0.30 mg/mL，然后进行梯度稀释，制备质量浓度分别为30，70，110，150和190 μg/mL的芦丁标准溶液。根据标准曲线的线性范围，配制合适浓度的各样品溶液，备用。
1.2.4.2 含量测定-硝酸铝显色法[11]
移取上述芦丁标准溶液各800 μL，分别加入到2.00 mL 1～5号容量瓶中，向0号容量瓶中加入800 μL溶剂，再各加40 μL 5% NaNO2溶液摇匀，放置6 min，加入40 μL 10% Al(NO3)3溶液摇匀，放置6 min，加320 μL 4% NaOH，再用蒸馏水定容，摇匀，放置10 min，于510 nm测定吸光度，绘制标准曲线。样品溶液在相同的条件下进行测定吸光度，根据标准曲线，计算样品中总黄酮的含量。
1.2.4.3 加标回收率测定
加入样品中黄酮含量80%，100%和120%的标准品芦丁，测定加标回收率。
2 结果与分析
2.1 虎耳草不同极性部位浸膏得率
500 g虎耳草粗粉经过80%乙醇浸泡、超声提取三次，减压旋蒸得到20.90 g浸膏，得率为4.18%，所得浸膏依次经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取后得到不同极性部位浸膏，分别为7.35，1.46，5.99和4.91 g，结果见表3。
表3 不同极性部位浸膏得率
2.2 虎耳草对DPPH抗氧化测定结果
从图1可看出：在相同的浓度下，样品3（乙酸乙酯萃取物）具有最高的清除DPPH自由基能力，而在相同的清除率时，其需要最小的浓度。五个样品清除DPPH自由基的能力均随浓度的增大而增强，具有剂效依赖性，且呈现线性关系，线性相关系数均在0.99以上，半抑制率IC50值分别为39.5，35.0，12.6，20.4和116 μg/mL，即对DPPH自由基的清除能力：样品3＞样品4＞样品2＞样品1＞样品5，但均弱于对照品VC（IC50=3.59 μg/mL），样品3清除DPPH自由基的能力约为VC的1/4，见表4。
表4 DPPH自由基清除曲线线性分析数据表
图1 虎耳草清除DPPH自由基的线性关系图
IC50是评价抗氧化能力强弱的常用指标，其值越小表示抗氧化能力越强。从图2可直观看出样品3的抗氧化能力最强，样品5的抗氧化能力最弱。样品3的抗氧化能力较接近对照品VC，其质量浓度在体系中达到22.5 μg/mL时，清除率高达84%，说明样品3具有较好的抗氧化性。
图2 虎耳草样品对DPPH自由基抗氧化能力
2.3 ABTS+抗氧化测定结果
从图3和表5可以看出，五个样品和VC清除ABTS+自由基的能力均随浓度的增大而增大，具有剂效依赖性，且表现很好的线性关系，线性相关系数均大于0.99，IC50值分别为19.9，18.8，4.90，13.9，53.4和3.35 μg/mL，其中样品3清除ABTS+自由基的能力显著优于其他四个样品，与VC很接近（见图4）。当样品3的浓度达到8.06 μg/mL时，清除率达到78%，表明样品3具有很好的抗氧化活性。
图3 虎耳草清除ABTS+自由基的线性关系图
图4 虎耳草样品对ABTS+自由基的抗氧化能力
表5 ABTS+自由基清除曲线线性分析数据表
2.4 虎耳草不同极性部位黄酮含量
2.4.1 标准曲线测定
以芦丁作为对照品测定标准曲线，在30～160 μg/mL的质量浓度范围内，芦丁质量浓度与吸光度具有良好的线性关系（见图5），线性方程为y=4.297 7x+0.01，线性相关系数为0.998 7（见表6），满足定量分析的要求，可用于总黄酮含量测定。
表6 芦丁标准曲线线性关系数据
图5 芦丁标准曲线
2.4.2 黄酮含量测定
虎耳草不同极性部位的五个样品均进行总黄酮含量分析，每个样品重复测定3次，结果见表7。总黄酮含量：样品3＞样品2＞样品4＞样品1＞样品5，其中样品3的总黄酮含量为38.4%，说明使用不用极性溶剂萃取实现了对活性成分的有效富集。计算公式为：总黄酮含量=×100%
表7 虎耳草五个样品的总黄酮含量测定数据（n=3）
2.4.3 加标回收率
加入样品中总黄酮质量的80%，100%和120%的标准品芦丁，测得回收率分别为99.9%，101.7%和96.0%，SRSD为2.94%。
2.4.4 重复性
每个样品均进行3次平行测定总黄酮含量，SRSD分别为1.33%，0.74%，1.51%，0.66%和0.43%，方法重复性很好。
2.5 抗氧化性与黄酮含量相关性分析
从DPPH和ABTS+两个抗氧化试验的测定结果可以发现，样品黄酮含量高则抗氧化性也高，抗氧化性和黄酮含量具有正相关性，相关性系数在0.65以上（表8）。样品3的黄酮含量最高，其表现出的DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清楚能力也最强，即抗氧化活性最强，很接近于对照品VC。
表8 抗氧化性与黄酮含量相关性数据表
3 讨论
黄酮类物质广泛存在于自然界，表现出很多生物活性，作为天然抗氧化剂开发是研究热点之一。此次试验深入分析了虎耳草不同极性部位的总黄酮含量及其抗氧化性，结果发现不仅每个样品的抗氧化性具有剂效依赖关系，而且不同样品的抗氧化性和黄酮含量之间具有较好的线性正相关关系，表明黄酮类物质可能是虎耳草具有抗氧化性的物质基础。乙酸乙酯萃取物的黄酮含量最高，其表现出的抗氧化能力也最佳，和对照品VC很接近。
在抗氧化性分析中，水萃取物在两个模型中的IC50值都很大，尽管随着质量浓度的增大也表现出很好的线性关系，但和黄酮含量的相关性缺失，初步分析可能是因于水萃取物的成分比其他样品更复杂，其他样品都可以很好溶于乙醇中，但水提物不能。因此，在做抗氧化性与黄酮含量相关性分析时，没有涉及水萃取物。
4 结论
使用不同极性溶剂可以实现对虎耳草活性成分的有效富集，乙酸乙酯萃取物（样品3）总黄酮含量最高，达到38.4%，表现出显著的DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力，IC50值分别为12.6和4.90 μg/mL，接近于对照品VC，表明样品3具有良好的抗氧化性。抗氧化性研究结果同时表明，虎耳草不同极性部位的抗氧化性和黄酮含量存在正相关性，黄酮含量越高，抗氧化能力也越强，说明黄酮可能是虎耳草表现出抗氧化性的有效成分。可据此进行中草药虎耳草作为天然抗氧化剂的深入开发和综合应用。
