酶解鱼鳔蛋白制备胶原蛋白肽饮品
2022-03-09刘丽君杨兰钦
刘丽君，杨兰钦
福州仁量生物制品有限公司（福州 350015）
我国水产资源丰富，水产品加工产生大量废弃物，对其进行综合再利用不仅节约资源，还能产生很大的经济效益。众多鱼类加工废弃物中都含有丰富的胶原蛋白，其中可食水生动物鱼鳔的蛋白质含量达80%，是一种蛋白质含量高、脂肪含量低、富含多种矿物质及微量元素的优质胶原蛋白来源[1-2]。以鱼鳔为原料，经过提取、精制生产，可得到相对分子质量低于10 000 Da的胶原蛋白肽。胶原蛋白肽具有较好的溶解性和热稳定性，在体内可被直接吸收，利用率高，且具有抗氧化、抗疲劳、增强免疫力等诸多功效，可被广泛应用于医药、保健食品、化妆品等领域[3-5]。近年来，胶原蛋白肽吸收性和生物活性的研究已取得较大进展[6-7]。有研究表明相比于蛋白质和游离氨基酸，肽类物质在肠道内不需降解直接被吸收，其转运速度快，吸收率更高，且相对分子质量越小吸收率越高[8-9]。相比其他来源，鱼源胶原蛋白肽的生物活性更优，且活性较高的胶原蛋白肽其相对分子质量一般在2 000 Da以下[10-11]。
胶原蛋白肽的提取方法有酸法提取、碱法提取、热水提取、酶法提取[12-13]。其中，酶法提取具有提取率高、条件温和、对胶原蛋白破坏性小等优势，还可以利用蛋白酶的专一性控制水解程度，制备不同分子量的多肽[14]。应用较多的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶。其中，木瓜蛋白酶具有对反应条件要求低、价格便宜等优点，从而得到广泛应用。更有报道称用木瓜蛋白酶水解鱼鳔比其他蛋白酶产生的多肽具有更高的抗氧化能力[15]。
相对分子质量是胶原蛋白肽重要的质量指标[16]。针对鱼鳔胶原蛋白肽的研究多以抗氧化性为主，以相对分子质量大小为提取目标的报道比较少见。故以胶原蛋白肽相对分子质量为考察指标，综合考虑其吸收性和生物活性的影响，采用木瓜蛋白酶酶解鱼鳔制备相对分子质量小于2 000 Da的胶原蛋白肽液，并测定其对DPPH自由基的清除率，配制成胶原蛋白肽饮品。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料
鱼鳔（干制品，购于福州市永辉超市）；低聚果糖（液体，山东百龙创园生物科技股份有限公司）。
1.1.2 主要试剂
木瓜蛋白酶（广州华琪生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；三氟乙酸（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胶原蛋白肽检测标样（上海博升生物科技有限公司）；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH，上海源叶生物科技有限公司）。
1.2 仪器与设备
电子分析天平（AEU-210型，日本岛津公司）；电热恒温水浴锅（HH-2型，余姚市科洋仪表厂）；高效液相色谱仪（LC-100型，上海伍丰科学仪器有限公司）；可见分光光度计（7230G型，上海仪电分析仪器有限公司）；离心机（TDL-80-2B型，上海安亭科学仪器厂）；pH计（PHS-25型，上海仪电科学仪器股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 鱼鳔胶原蛋白肽液的制备。
干鱼鳔加水浸泡过夜，洗净沥干水分后剪碎，加入干品质量35倍的去离子水，匀浆。在自然pH条件下加入适量木瓜蛋白酶进行酶解。于100 ℃水浴灭酶10 min，以4 000 r/min离心10 min，得到的上清液为鱼鳔胶原蛋白肽液。
1.3.2 鱼鳔酶解条件响应面优化试验。
在前期单因素试验基础上，选择酶解温度、酶解时间、加酶量作为关键因子，应用软件Design-Expert进行试验设计，以相对分子质量低于2 000 Da的胶原蛋白肽所占比例为考察指标，确定最优酶解条件。因素水平设计见表1。
表1 酶解响应面优化试验因素与水平
1.3.3 胶原蛋白肽相对分子质量的测定。
参照GB 31645—2018附录A相对分子质量小于10 000 Da的胶原蛋白肽所占比例的检测方法（高效体积排阻色谱法）[17]。采用的分离柱为TSK Gel G2000 SWXL，流动相为乙腈、水、三氟乙酸，体积比40∶60∶0.05，流速0.5 mL/min，检测波长220 nm。标准品采用细胞色素C（MW12384）、抑肽酶（MW6512）、杆菌酶（MW1423）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）。相对分子质量的对数（lgMW）与保留时间的标准曲线方程为Y=-0.171 59X+6.837 2，相关系数R2=0.977 0，式中Y表示保留时间，单位为min，X表示相对分子质量的对数（lgMW）。根据标准曲线，用峰面积归一化法计算相对分子质量低于2 000 Da的胶原蛋白肽所占比例。
1.3.4 DPPH自由基清除率的测定。
将最优酶解条件下得到的样品溶液与试剂溶液混合均匀，用分光光度法测定其在517 nm处的吸光度[18]。
1.3.5 胶原蛋白肽饮品的生产操作要点及检验分析。
将鱼鳔胶原蛋白肽液加入适量的低聚果糖进行调味，以改善其口感，增加其溶解性和透明度[19-20]。调配后进行灌装扎盖和湿热灭菌，制成胶原蛋白肽饮品后，依据GB 7101—2015《食品安全国家标准 饮料》分析理化指标和卫生指标[21]进行检验分析。
2 结果与分析
2.1 鱼鳔胶原蛋白酶解响应面优化试验结果
2.1.1 模型建立与方差分析
对表2试验数据进行回归拟合分析，得到相对分子质量小于2 000 Da的多肽占比Y的二次回归编码方程模型：Y=98.59+1.10X1+0.54X2+0.71X3-0.025X1X2+ 0.26X1X3-0.31X2X3-1.32X12-0.099X22-0.39X32。
表2 试验设计及结果
由方程可看出各因素对低于2 000 Da的多肽占比影响程度为酶解温度X1＞加酶量X3＞酶解时间X2，并且各因素对低于2 000 Da的多肽占比呈正相关。
由表3方差分析可知：p模型＜0.000 1，表明建立的回归模型达到极显著水平；FLf=0.41，pLf=0.754 6＞0.05，表明失拟项差异不显著；相关系数R2=0.988 8，调整确定系数Radj2=0.974 4，表明该模型能描述97.44%的响应值变化。综上表明，该模型拟合度高，能较好地解释各因素与响应值之间的关系。
表3 回归模型方差分析
上述回归方程系数显著性检验表明，模型的一次项X1、X3，二次项X12对低于2 000 Da的多肽占比影响极显著（p＜0.000 1）；一次项X2，二次项X32及交互项X1X3、X2X3对低于2 000 Da的多肽占比影响显著（p＜ 0.05）；其余项影响均不显著。
2.1.2 酶解条件的优化和验证。
通过Design-Expert软件分析，结合实际生产应用，得出酶解鱼鳔胶原蛋白的最优条件：酶解温度62 ℃，酶解时间9 h，加酶量2.17%。在此条件下测得相对分子质量低于2 000 Da的多肽占比为99.0%，与理论预测值99.2%只相差0.2个百分点，说明所建立的数学模型对胶原蛋白肽的实际生产具有指导意义。
2.1.3 胶原蛋白肽分子量分布。
在最优酶解条件下得到的胶原蛋白肽相对分子质量分布色谱图见图1。
图1 胶原蛋白肽相对分子质量分布色谱图
经标准曲线计算得到胶原蛋白肽液相对分子质量的分布范围，如表4所示。
由表4可知，胶原蛋白肽液相对分子质量主要集中在300～1 000 Da，占比为84.23%，相对分子质量小于1 000 Da的多肽占比为89.53%，说明在最优酶解条件下得到的胶原蛋白肽液主要是小分子肽，能够有较好的吸收性。
表4 胶原蛋白肽液相对分子质量分布
2.2 DPPH自由基清除率的测定结果
在最优酶解条件下得到的鱼鳔胶原蛋白肽液对DPPH自由基的清除率为85.4%，与孙燕丽等[15]报道的草鱼鱼鳔酶解液对DPPH自由基的清除率相比，高出6.5%。说明相对分子质量低于2 000 Da的鱼鳔胶原蛋白肽液具有较高的抗氧化能力。
2.3 胶原蛋白肽饮品检测结果
2.3.1 感官指标
色泽 滋味、气味 状态淡黄色液体 甘甜适口、味道柔和,无异味 清亮透明,无杂质
2.3.2 理化指标
铅 (以Pb计)/(mg·L-1) 结果检测值 标准＜0.05 ≤0.3 符合要求
2.3.3 卫生指标
符合商业无菌的要求。
3 结论
采用木瓜蛋白酶对鱼鳔进行酶解，利用响应面模型对酶解关键因素进行探讨，得到最优酶解参数：酶解温度62 ℃，酶解时间9 h，加酶量2.17%。在该条件下制备鱼鳔胶原蛋白肽，相对分子质量低于2 000 Da的多肽占比为99.0%，此胶原蛋白肽液对DPPH自由基的清除率为85.4%。利用鱼鳔胶原蛋白肽液制备的胶原蛋白肽饮品，其产品符合饮料的理化卫生指标。后续将研究鱼鳔胶原蛋白酶解液复配其他功效成分，制备具有不同保健功能的饮品。
