毛蚶及其酶解产物的功能性评价和比较

李婷菲　叶斌

摘 要：目的：对毛蚶及其胰蛋白酶水解产物进行功能性评价和比较。方法：通过正交实验优化胰蛋白酶水解条件，并对毛蚶水解产物和毛蚶进行蛋白含量、氨基酸成分和抗氧化活性的检测和比较。结果：通过胰蛋白酶的水解，毛蚶的营养价值和肽含量明显提高，并表现出更强的抗氧化活性。结论：胰蛋白酶处理过的毛蚶具有更明显的药用活性，为进一步研究后者的药用价值提供依据。

关键词：毛蚶 胰蛋白酶 抗氧化性

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）03（a）-0247-04

Abstract：Objective Function evaluation of Arca subcrenata Lischke and its trypsin hydrolysates.Methods The preparation of hydrolysates were optimized in orthogonal experiments，and we evaluated the effects of Arca subcrenata Lischke and its trypsin hydrolysates，including of the content of protein，the amino acid composition and the antioxidant properties.Results The hydrolysates prepared with trypsin had an higher nurtritional value and peptide content，and showed a stronger antioxidant activity.Conclusion The hydrolysates prepared with trypsin showed more obvious activity than Arca subcrenata Lischke.

Key words：Arca subcrenata Lischke；Trypsin；Antioxidant activity

英国学者Harman在20世纪50年代中期首次提出了自由基学说[1]，自由基学说是一种具有代表性的致衰学说。人体在进行各项生命活动时，会产生一种中间代谢物，该物质称为自由基。而自由基过多时就会对核酸、蛋白质等物质造成一定的伤害，从而引起机体的损伤，这也是造成帕金森综合征、肝炎、癌症等疾病的主要因素[2]。因此，研究和制造一种安全且无毒害作用的天然抗氧化剂成为现今备受瞩目的课题。

现阶段新型保健品和药物的一个主要来源是海洋制品。海洋生物在自身的新陈代谢过程中会产生各种各样的且具有特殊生理功能的活性物质，且有一些活性物质很难在陆地生物的体内发现，因此为海洋生化药物和功能性保健品的研发提供了充足的原料。例如，分布在西太平洋的中国、朝鲜、日本沿岸的毛蚶就是一种海产经济贝类，且还是一种常见的药物和食物。中医学上记载，用毛蚶治疗炎症、贫血、肿瘤等疾病已有几百年的历史。另外，毛蚶的水解产物不仅可以降低由四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠的血糖活性，还可以降低高血脂症实验小鼠的血脂[3]。王勇等[4]也从毛蚶中分离纯化出有抗氧化活性成分的糖肽。

但是天然存在的活性成分大部分或含量微少，或提取难，不足以大量生产供给所需，因此，人们更多地把目光投向开发体外水解产物这条途径上来。该文通过对毛蚶及其胰蛋白酶水解产物的一些功能性比较和研究，为其开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料为：毛蚶（山东青岛），二苯代苦味胼基自由基（DPPH）标准品（美国Sigma公司），胰蛋白酶（广西庞博生物工程有限公司），其他试剂均为国产分析纯。

仪器为：组织捣碎机，ICS-2500离子色谱分析仪（美国戴安公司），Heto-FD1.0-60E低压冷冻干燥机（Heto-Helten公司），UV2450紫外分光光度计（Shimadzu公司），CR21G高速冷冻离心机（日本日立公司），DF-Ⅱ集热型磁力加热搅拌器（江苏金坛市医疗仪器厂），pHS-25数显酸（上海虹益仪器仪表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛蚶胰蛋白酶解工艺过程

首先把毛蚶清洗并且沥干，按照1：1（W：V）的比例加入蒸馏水，放入组织捣碎机中以12000r/min的转速运转3min后制成样品匀浆。随后调节匀浆的pH值至所需值，再把胰蛋白酶按照一定的比例加入其中，进行水解。这里需注意，水解时要保持恒定的温度和pH值。接着，反应完成后，把水解液加热到90℃，保持15min，进行灭酶[5]。最后等水解液冷却后，用15000r/min的转速离心20min，4℃冷冻，上清液冷冻干燥，保存备用。另外，取部分匀浆，以相同的条件冷冻离心，取上清液，即为毛蚶的可溶性蛋白粗品，冷冻干燥后保存备用。

1.2.2 正交试验

选择酶解时间、酶用量、pH值以及温度为实验因素，采用了L9（34）正交表对胰蛋白酶的水解条件进行优化。见表1。

1.2.3 测定酶解液水解度（DH）

采用pH-stat法控制和测定水解过程。为保持水解时的pH值恒定，需要不断加入NaOH，且根据碱的消耗量来计算水解度（DH），公式如下[6-7]：

DH（%）=[B Nb/Mp α htot]×100

B——消耗的碱体积，单位为mL；Nb——碱液浓度，单位为mol/L；Mp——水解反应中蛋白质总量，单位为g；α——α—氨基的平均解离常数[8]；htot——底物蛋白质中肽键的总数，单位为mmol/每克蛋白质，具体取值为8.0[9]。

1.2.3 测定蛋白浓度

采用Folin-酚试剂法测水解产物蛋白浓度[10]。

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 对DPPH自由基的清除能力

首先把待测样品配置成20mg/mL是溶液，然后取出7份不同体积的样品，最后用反渗透水把这些样品稀释至2mL，备用。根据Shimada[11]所采用的方法，取浓度为0.2mmol/Ld的DPPH的乙醇溶液0.5mL加入到2mL的上述样品中混合，每个浓度做3个平行，对照组选用2ml蒸馏水，在室温下放置30min，最后在517nm处测吸光度。同时做空白对照。用下述公式计算样品对DPPH的清除率：

清除率%={1-（S-SB）/（C-CB）}×100

S——样品加DPPH的吸光度；SB——样品加蒸馏水的吸光度；C——蒸馏水加DPPH的吸光度；CB——蒸馏水加蒸馏水的吸光度。

1.2.4.2 对H2O2的清除作用

取7份不同重量的待测样品，用浓度为0.lmol/L，pH值为7.4的磷酸缓冲液稀释至5mL，取0.6mL浓度为4mol/L的H2O2溶液加入到3.4mL的上述溶液中，静置l0min，混合液在230nm下测定吸光值，与不加样品的H2O2溶液进行对比。每个浓度做三个平行。用下述公式计算对H2O2的清除率：

清除率%={1-（S-SB）/（C-CB）}×100

S——样品加H2O2的吸光度；SB——样品加蒸馏水的吸光度；C——蒸馏水加H2O2的吸光度；CB——蒸馏水加蒸馏水的吸光度[12]。

1.2.5 测定氨基酸含量

对于蛋白酶水解产生的氨基酸含量及其种类的分析需要采用离子色谱分析仪，根据文献[13-14]所述的方法，先处理游离氨基酸测定样品和总氨基酸测定样品。分析条件如下所示。（1）色谱柱：Amino PAC PA10，2×250mm；（2）进样体积：25μL；（3）柱温：30℃；（4）流速：0.25mL/min；（5）流动相：去离子水、NaAC、0.25mol/L NaOH。

2 结果与讨论

2.1 酶解海洋生物QHR条件的优化

选择酶解时间、酶用量、pH值以及温度为实验因素，指标为酶解液水解度（DH），采用正交表L9（34）对中性蛋白酶水解毛蚶蛋白的条件进行优化，结果见表2所示。其中水解度是三个平行实验结果的平均值（P<0.05）。

根据正交试验结果的R值可以看出，胰蛋白酶最重要影响因素是酶底比。同时由k值，可得出胰蛋白酶的最佳水解温度为40℃，水解时间是5小时，E/S值是2.5%，pH为8.5。我们根据此最佳水解条件，对样品进行处理，并对毛蚶样品及其水解产物进行抗氧化活性测定。

2.2 酶解产物蛋白含量

标准曲线如图1所示。

酶解产物及毛蚶的蛋白含量如表3所示。

（1）样品溶液根据标准曲线得出的浓度。

（2）实际浓度为样品溶液稀释前的浓度，即浓度的数值乘以20倍。

由表3可知，蛋白的含量在蛋白酶酶解后有显著的提高。这是因为毛蚶中有很多的蛋白无法和其他组织缔结或者不溶于水，而这些蛋白经过胰蛋白酶的作用后，断开了与疏水基因或其他组织的连接，暴露出亲水组织，从而可以与水相容并被提取出。

2.3 毛蚶及其酶解产物的氨基酸分析

该实验在对毛蚶和其胰蛋白酶产物进行氨基酸的含量和种类测定时，采用的是高效离子交换色谱-积分脉冲安培法，结果见表4。

从表4可以看出，经过胰蛋白酶的水解后，各种氨基酸的含量都有所增加，毛蚶及其水解产物的必需氨基酸含量分别为30.53%和35.47%，胰蛋白酶作用下毛蚶的营养价值有一定的提高。同时，胰蛋白酶水解后，产物的肽含量也相当高，说明胰蛋白酶对毛蚶主要起着内切酶的作用，而海洋生物的肽多具有生物活性，因此，我们认为胰蛋白酶对毛蚶药用活性成分的研究有非常重要的意义。

2.4 抗氧化活性

该文比较了毛蚶及其胰蛋白酶水解产物的清除DPPH自由基和H2O2的能力，其中抗坏血酸为阳性对照，清除率为三次平行实验结果的平均值（P<0.05）。结果见图2、图3。

根据上述实验结果可知，毛蚶和其水解产物均可以在一定程度上清楚DPPH自由基和H2O2，且随着样品浓度的增加，清除率曲线呈线性上升趋势，因此其清除作用与浓度有关，酶解产物的活性越强，上升趋势越明显。通过线性方程，可以计算出胰蛋白酶水解产物对DPPH自由基清除作用的EC50值为7.44mg/ml，对H2O2清除作用的EC50值为20.88mg/ml。有报道[15]牡蛎的537酸性蛋白酶酶解产物对DPPH清除作用的EC50为8.08mg/ml，毛蚶的胰蛋白酶水解产物的清除活性优于牡蛎酶解产物。

3 结语

该文通过正交试验，以水解度DH为依据，对胰蛋白酶的最佳水解条件进行了筛选，得到其最佳水解温度为40℃，水解时间是5小时，E/S值是2.5%，pH为8.5。同时对毛蚶及其酶解产物进行了功能性评价，实验证明，通过胰蛋白酶的水解，毛蚶的蛋白含量大幅度地提高，必需氨基酸含量提高约5%，肽含量也明显增加，同时对DPPH自由基和H2O2也表现出更强的清除能力，EC50值分别为7.44mg/ml和20.88mg/ml，是一种潜在的保健品和药品生产原料。综上所述，我们认为胰蛋白酶的处理提高了毛蚶的抗氧化活性和营养价值，这一结果对毛蚶活性成分的研制有非常重要的意义。

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