斑马鱼蛋白酪氨酸硫酸化修饰的检测方法研究

张婷婷，刘峰

技术与方法

斑马鱼蛋白酪氨酸硫酸化修饰的检测方法研究

张婷婷1,2，刘峰2

1. 中国科学技术大学生命科学与医学部，合肥 230026 2. 中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室，中国科学院大学，北京 100101

蛋白酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation, PTS)是一种重要的翻译后修饰，调控生命活动中多种生理和病理过程，但由于PTS状态不稳定且目前缺乏有效的富集方法，因此在生物样品中难以进行有效地检测。本研究以模式动物斑马鱼()为研究材料，利用Orbitrap Exploris 480高分辨质谱仪检测了斑马鱼胚胎发育早期总蛋白的酪氨酸硫酸化修饰水平，通过该方法共计检测到26种蛋白(包括膜蛋白、分泌蛋白、胞质蛋白和核蛋白等)存在潜在的29个酪氨酸硫酸化修饰位点。本研究建立了斑马鱼胚胎发育早期蛋白酪氨酸硫酸化修饰的检测方法，为探索生物体蛋白硫酸化修饰的作用机制奠定了技术基础。

斑马鱼；蛋白酪氨酸硫酸化；高分辨质谱

蛋白酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation, PTS)是真核生物中一种常见的翻译后修饰，该修饰于1954年在一种源自牛纤维蛋白原的多肽中被首次报道[1]。硫元素主要以无机硫酸盐的形式存在于生物体中，它需要代谢活化成有机硫酸盐才能被生物体进一步利用。在这一过程中，无机硫酸盐与腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)在ATP硫酸化酶的催化下反应形成腺苷-5′-磷酸硫酸盐(adenosine-5′-phosphosulfate, APS)和焦磷酸盐；随后，APS与ATP在APS激酶催化下形成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate, PAPS)和腺嘌呤核苷二磷酸(adenosine diphosphate, ADP)；最后，酪氨酸蛋白硫酸转移酶(tyrosylprotein sulfotransferase, TPST)将活化的硫酸基团从PAPS转移到多种蛋白质和多肽中的酪氨酸活性基团上[2]。

酪氨酸硫酸化修饰在动植物中均有报道。酪氨酸硫酸化多肽是植物生长发育的关键调控因子[3]，例如：拟南芥()成熟胚乳释放硫酸化的凯氏带完整性因子(casparian strip integrity factors, CIFs)家族的CIF2多肽，以及含酪氨酸硫酸化植物多肽(plant peptides containing sulfated tyro­sine, PSYs)家族的PSY1多肽，共同促进幼苗角质层的发育[4]。近年来，科学家逐渐认识到PTS在动物发育过程中的作用及其与疾病的联系。该修饰可以调节细胞外蛋白与蛋白之间的相互作用，进而引发多种生理和病理反应[5]。在哺乳动物中，趋化因子受体CXCR4、CXCR3和CX3CR1可被酪氨酸硫酸化[6,7]。其中，CXCR4是七次跨膜结构域G蛋白偶联受体，其N端硫酸化修饰的第7、12和21位酪氨酸位点可以促进CXCR4与趋化因子CXCL12结合，从而诱导G蛋白激活[8]。P-选择素糖蛋白配体-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)在细胞表面以二硫键连接的二聚体形式表达。PSGL-1包含胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域[9]，当机体发生炎症反应时，中性粒细胞上发生硫酸化修饰后的PSGL-1与内皮细胞表达的P-选择素之间的亲和力会加强，进而介导中性粒细胞的黏附及其向炎症部位的迁移[10]。在动脉粥样硬化小鼠()模型中，造血祖细胞TPST活性的丢失可显著减轻小鼠动脉粥样硬化症状，其原因在于硫酸化的PSGL-1和CX3CR1会参与白细胞的募集[11]。

PTS在细胞内的丰度很低，因缺乏有效的硫酸化肽段富集方法，在生物样品中难以检测。目前，仅在膜蛋白和分泌蛋白中检测到硫酸化修饰，其中包括人类()和小鼠中的趋化因子受体、PSGL-1以及水蛭()唾液腺分泌的水蛭素等[12,13]。作为脊椎动物模型之一，斑马鱼()在发育生物学以及疾病研究等方面的应用较为广泛，但是有关其体内的蛋白酪氨酸硫酸化修饰位点的研究却尚未见有相关报道。

质谱技术是一种常用的检测蛋白质翻译后修饰的方法，其中有效富集修饰的方法对于PTS的检测至关重要[14]。本研究首先采用弱阴离子交换柱(weak anion exchange column，WAX column)富集斑马鱼胚胎总蛋白样品中的硫酸化肽段，随后利用Orbitrap Exploris 480高分辨质谱仪检测斑马鱼中潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点。本研究共发现26种蛋白存在潜在的29个酪氨酸硫酸化修饰位点，为今后探究斑马鱼PTS的作用机制提供了基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和仪器

研究使用的实验试剂、实验仪器以及相关溶液配制的详细信息见表1～3。

1.2 斑马鱼胚胎总蛋白提取和浓度测定

首先，取约40枚脱膜的受精后5.5天野生型斑马鱼胚胎，吸干水分，放在液氮中速冻后加入240 μL 8 mol/L尿素裂解液，立即进行超声处理(程序设定：工作30 s，暂停90 s，8个循环)。随后，将样品于4℃静置1 h以上，15,000 r/min离心15 min；取上清液至新的EP管中，再次15,000 r/min离心15 min。取20 μL上清样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定(后续实验依据此浓度进行蛋白定量)。

1.3 考马斯亮蓝染色法检测蛋白样品质量

取40 μg蛋白样品(具体体积视蛋白浓度而定)，加入1/5体积的蛋白上样缓冲液，置金属浴98℃约10 min。随后，配置12% SDS-PAGE蛋白凝胶，将蛋白样品点入胶孔。电泳结束后，切取相应的凝胶，放入适量考马斯亮蓝染液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于侧摆摇床上以20 r/min，摇动12 h。次日，倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶，置于侧摆摇床上缓慢摇动。期间更换脱色液4～6次，直至蓝色背景基本上全部被洗脱，并且蛋白条带染色效果达到预期。

表1 实验试剂

表2 实验仪器

表3 溶液配制

1.4 酶切法制备肽段

采用溶液内酶切法(in solution digestion)制备肽段和C18脱盐柱进行脱盐[15～17]。

首先，将蛋白样品溶于8 mol/L尿素中(含50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.0)，加入10 mmol/L DTT (终浓度)，37℃孵育4 h后取出放至室温。随后，加入50 mmol/L IAA (终浓度)，室温避光反应1 h。用50 mmol/L NH4HCO3稀释至1/8后，加入蛋白质量2%的胰酶(溶于50 mmol/L NH4HCO3)，37℃孵育过夜(约18 h)。次日，将酶切的样品取出，加入1% TFA (终浓度)，终止酶切反应。

终止反应后，采用C18脱盐柱进行脱盐。首先，用封口膜将脱盐柱固定在固相萃取机的孔位上，依次加入100% MeOH、70% ACN，0.1% FA、0.1% FA，活化C18柱。待液体完全流出后，向脱盐柱中注入全部样品。随后，向脱盐柱中注入0.1% FA，重复3次，用100% MeOH溶液清洗C18柱，收集溶液进行冻干(程序设定：设置温度30℃，开始浓缩，后期更改为20℃，直至样品管底部看不到液滴)。冻干后样品存于–20℃备用。

1.5 弱阴离子交换柱富集硫酸化肽段

采用弱阴离子交换柱(WAX column)富集硫酸化肽段[14]和StageTips式脱盐处理[18]，对用于检测PTS的酶切样品进行质谱上机前处理。首先，用50 mmol/L NH4Cl溶液预处理弱阴离子交换柱(WAX column)，将用50 mmol/L NH4Cl重悬的酶切产物溶液过柱。随后，梯度NH4Cl溶液(200 mmol/L, 400 mmol/L, 600 mmol/L, 800 mmol/L, 1 mol/L, 2 mol/L, 4 mol/L)依次过柱，收集7次过柱溶液进行冻干。

冻干样品采用Empore固相萃取膜片制作的StageTips进行脱盐。首先，截取合适体积的柱体，用100% MeOH洗柱，保持柱子湿润，依次用Buffer B (80% ACN，0.5% AcOH)和Buffer A (0.5% AcOH)洗柱。随后，将用100% MeOH重悬的样品过柱，用Buffer A洗柱后，用Buffer B洗柱2次，收集过柱液。冻干后，向冻干粉中加入0.1% FA，使蛋白浓度约为0.5 μg/μL。最后，将样品转移至30 μm孔径的过滤柱中，14,000 r/min 离心10 min，离心结束后，取8 μL转移至样品管，用Orbitrap Exploris 480质谱仪进行检测。

1.6 质谱数据分析

质谱采集到的数据使用Proteome Discoverer (ver. 1.4.0.288, Thermo Fisher)软件进行分析比对，比对数据库中斑马鱼Fasta格式蛋白质序列下载于UniProt网站(https://www.uniprot.org/)。分析参数设定：(1)固定修饰：Carbamidomethyl (C)；(2)可变修饰：Sulfo(Y)，Oxidation(M)和N端deamidated；(3) MS tolerance为10 mg/L，MS/MS tolerance为0.6 Da； (4)可信蛋白质的筛选条件：unique peptide≥1， FDR≤0.01。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼胚胎蛋白的酪氨酸硫酸化修饰检测

斑马鱼胚胎蛋白的酪氨酸硫酸化修饰检测流程如图1A所示。首先，用尿素裂解液提取斑马鱼胚胎期总蛋白，并利用考马斯亮蓝染色法检测蛋白丰度(图1B)。随后，通过酶切制备总蛋白的肽段，并对肽段进行质谱检测，经分析比对后，共鉴定出2861种蛋白，酶切肽段的质量准确度分布图显示理论值和实际值之间的误差落在±10 mg/L区间内(图1C)。为了进一步富集硫酸化肽段，本研究用弱阴离子交换柱(WAX column)对酶切肽段进行处理，并依次收集7次过柱溶液。最后，本研究采用Orbitrap Exploris 480质谱仪检测富集后的肽段，通过Proteome Dis­coverer软件比对，鉴定出斑马鱼胚胎期总蛋白中26种蛋白潜在的29个酪氨酸硫酸化修饰位点(表4)。

图1 斑马鱼胚胎期总蛋白酶切肽段质量控制

A：斑马鱼胚胎期总蛋白酪氨酸硫酸化修饰检测流程图；B：考马斯亮蓝染色法检测蛋白样品的条带丰度，两条Urea lane是技术重复；C：酶切肽段的质量准确度分布图，显示测量误差分布在±10 mg/L以内。

2.2 蛋白酪氨酸硫酸化修饰位点的分析

基于斑马鱼ZFIN数据库(https://zfin.org/)和UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)的信息，以及相关文献报道。在26种存在潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点的蛋白中，CD44a[19]、Lancl1和Adgrf3b[20]定位于细胞质膜；Myof、Mao、Ptprfa、Si:ch211- 264f5.6、Pgrmc1[21]、Ap1m1、Calua和Rasgrf2参与膜的组成；Serpine1和Serpinc1为分泌蛋白；Ybx1[22]、Mybpc3[23]、Ifit17c、Ttll10、Ttn.1、Si:dkey-15f17.8和Si:ch211-278p9.2定位于细胞质；Nucks1a[24]、Nfatc1和Cnot1定位于细胞质或细胞核；P2rx1、Spen和Rprd1b定位于细胞核。

表4 斑马鱼胚胎中26种蛋白潜在的29个酪氨酸硫酸化修饰位点

以蛋白CD44a和Mybpc3为例，本研究检测到CD44a蛋白的AGELCQSLG-Y(SO3)-R肽段序列的第10位酪氨酸硫酸化位点可能发生硫酸化修饰 (图2A，附图1A)，该位点位于CD44a蛋白的第59位氨基酸，且处于CD44a蛋白的Xlink功能区域(33～122位氨基酸)中。功能上，CD44a介导PI3K-Akt信号通路的激活对斑马鱼幼体的存活至关重要[25]。肌球蛋白结合蛋白C3(myosin binding protein C3，Mybpc3)的QLEV-Y(SO3)-QSIADLTVK肽段序列的第5位酪氨酸硫酸化位点可能发生硫酸化修饰(图2B，附图1B)，该位点位于Mybpc3蛋白的第558位氨基酸，且处于Mybpc3蛋白的I-set功能区域(555～637位氨基酸)中。有研究报道，Mybpc3缺失会导致斑马鱼心肌肥厚和舒张功能障碍，再现了人类心肌肥厚和舒张性心力衰竭的形态学、机械和电生理表型[26]。此外，本研究鉴定出的其他潜在酪氨酸硫酸化修饰位点，为之后探究其生物学功能提供了线索。

图2 CD44a和Mybpc3蛋白潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点

A：CD44a蛋白潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点；B：Mybpc3蛋白潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点。

3 讨论

PTS作为一种翻译后修饰，在动植物发育等生理条件和病理条件下发挥着重要的作用。除了通过生物信息学分析预测酪氨酸硫酸化修饰潜在的位点外，硫酸化修饰检测方法还包括放射性法[27]，比色法[28]，荧光法[29]以及质谱法[30]。放射性法的灵敏度高，但操作步骤繁琐；比色法通量高，但灵敏度低；荧光法实时快速，但低水平荧光不易检测；质谱法的灵敏度高，通量高，更加精确。所以，质谱分析是鉴定生物样品中蛋白酪氨酸硫酸化修饰常用的方法。然而，生物体蛋白酪氨酸硫酸化修饰基团的相对分子质量(约为79.956815)和蛋白酪氨酸磷酸化修饰基团的相对分子质量(约为79.966331)十分接近，两者之间的相对分子质量仅相差0.009516，硫酸化修饰丰度远低于磷酸化修饰的特点，导致质谱法鉴定蛋白酪氨酸硫酸化修饰面临很多困难[31]。因此，本研究发现的26种蛋白是否真的存在硫酸化修饰还需要进行重复检测工作及进一步实验验证。此外，蛋白酪氨酸硫酸化修饰基团在质谱实验中易分解发生中性丢失现象，也可能导致假阴性结果[32]。

本研究中，通过酶切处理后，在斑马鱼胚胎期总蛋白溶液中检测到2861种蛋白。随后，仅发现26种蛋白潜在的29个酪氨酸硫酸化修饰位点。无论是总蛋白数量还是有潜在的修饰位点的蛋白数目都偏低。经分析可能的原因如下：(1)蛋白提取不充分；(2)某些蛋白丰度很低；(3)硫酸化修饰不稳定；(4)溶液内酶切提取难溶蛋白效率低。针对上述问题，第一，可进一步优化蛋白提取方法，包括蛋白裂解液的选择、超声处理时间等。第二，对于一些丰度比较低的蛋白，可以先采用过表达等方式增加蛋白丰度，再采用SDS-PAGE蛋白胶内酶切的方法，对某一特定条带蛋白进行质谱样品上机前处理[33]。第三，酪氨酸硫酸化修饰容易在蛋白样品处理过程中丢失，尤其是在酸性条件下，所以，在实验过程中要尽可能避免酸性环境或减少蛋白样品处于酸性环境中的时间。第四，可以尝试用SDS蛋白裂解液提取蛋白，之后采用基于超滤辅助的样品制备处理(filter-aided sample preparation, FASP)法进行酶切处理，FASP法可以在一定程度上避免溶液内酶切对一些难溶蛋白提取不充分的问题[34,35]。此外，本研究鉴定出的斑马鱼26种蛋白潜在的酪氨酸硫酸化修饰的肽段序列在人和小鼠中只有部分是保守的。以Pgrmc1蛋白的LLKPGEEPTE-Y(SO3)-TDDEEVKDK肽段序列和CD44a蛋白的AGELCQSLG-Y(SO3)-R肽段序列为例，在UniProt中通过Blast比对出人和小鼠中这两种蛋白对应的肽段序列，其中，斑马鱼Pgrmc1蛋白的酪氨酸位点在人和小鼠中保守，暗示人和小鼠中该位点也可能发生硫酸化修饰；但是CD44a蛋白的酪氨酸位点在人和小鼠中不保守，这可能是因为斑马鱼基因有多个拷贝，在人和小鼠中没有相对应的序列。

本研究建立了基于高分辨质谱检测斑马鱼蛋白酪氨酸硫酸化修饰的方法，丰富了蛋白硫酸化修饰的检测手段。此外，本研究发现的26种蛋白中潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点可能在斑马鱼胚胎早期发育中有着十分重要的功能，为后续蛋白功能及分子机制探索提供了参考。基于目前的蛋白硫酸化修饰检测流程，还需要进一步优化蛋白提取条件、酶切方式等，以便检测到更丰富的蛋白种类，发现更多的蛋白酪氨酸硫酸化修饰位点。

感谢本实验室马东媛博士对文章的阅读和修改。

附加材料见文章电子版www.chinagene.cn。

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附图1 CD44a和Mybpc3蛋白潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点

Supplementary Fig. 1 The potential tyrosine sulfation modification sites of CD44a and Mybpc3

A：图2A的整个质谱峰图，虚线框内显示CD44a蛋白潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点；B：图2B的整个质谱峰图，虚线框内显示Mybpc3蛋白潜在的酪氨酸硫酸化修饰位点。

Study on a detection method of protein tyrosine sulfation modification in zebrafish

Tingting Zhang1,2, Feng Liu2

Protein tyrosine sulfation (PTS) is an important post-translational modification that regulates a variety of physiological and pathological processes. However, PTS is unstable and lacks effective enrichment methods, which make it difficult to be detected in biological samples. In this study, we detected the tyrosine sulfation modification level of total proteins in developing zebrafish embryos by using high-resolution mass spectrometer, Orbitrap Exploris 480. A total of 26 proteins with tyrosine sulfation were detected, including membrane proteins, secreted proteins, cytoplasmic proteins and nucleoproteins. This study established a methodology in detecting protein tyrosine sulfation modification in embryonic zebrafish, which paved the way for evaluating the biological function of PTS.

zebrafish; protein tyrosine sulfation; high resolution mass spectrometry

2022-01-23;

2022-02-02;

2022-02-09

国家重点研发计划(编号：2018YFA0800200，2018YFA0801000)、国家自然科学基金委重点项目(编号：32030032，31830061)和中国科学院战略性先导科技专项(编号：XDA16010207)资助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (Nos. 2018YFA0800200, 2018YFA0801000), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 32030032, 31830061), and the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, China (No. XDA16010207)]

张婷婷，在读硕士研究生，专业方向：生物工程。E-mail: zhangtingting@ioz.ac.cn

刘峰，博士，研究员，研究方向：血液与心血管发育生物学。E-mail: liuf@ioz.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-018

(责任编委: 孙永华)