β-1,3-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达与性质

2022-03-07张佳妮喻晓蔚

食品与生物技术学报 2022年2期

张佳妮，徐岩，喻晓蔚*

（1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122）

内切β-1，3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.39和3.2.1.6）作用于β-葡聚糖主链中的β-1，3-糖苷键，在制备活性葡寡糖、酵母裂解、预防真菌病害等方面有广泛应用[1-2]。来源于藤黄节杆菌的βglⅠ（Athrobacter luteu ATCC 21606，βglⅠ）是糖苷水解酶64家族的内切型β-1，3-葡聚糖酶，该酶在酵母裂解活性上具有突出优势，可用于酵母营养物的抽提[1]。酵母细胞内富含蛋白质、氨基酸和核苷酸，其抽提物在食品风味改善上具有广泛应用，采用条件温和的酶解法进行细胞破壁，营养成分损失小，可有效利用胞内营养物质[3]。但是野生菌的βglⅠ表达水平低，仅3.5 U/mL[4]，因而商品化的藤黄节杆菌β-1，3-葡聚糖酶成本高，价格昂贵，亟待提高该酶的表达水平。薛伟[5]等人利用大肠杆菌胞内表达βglⅠ，粗酶液裂解活性达161 U/mL，但革兰氏阴性细菌会产生内毒素等有害成分，不适于进行食品表达应用。食品级安全菌株枯草芽孢杆菌常作为原核外源蛋白质分泌表达的宿主，主要通过蛋白质的转录、翻译、转运和折叠等方面优化来提高异源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的表达量[6-8]。

在本研究中，利用枯草芽孢杆菌异源表达βglⅠ，通过优化筛选信号肽、RBS、5′UTR序列以期获得βglⅠ的高产菌株，并对βglⅠ进行纯化及酶学性质研究。

1 材料与方法

1.1 菌种和质粒

Bacillus subtilis WB600、Escherichia coli JM109和表达质粒pNSWP：江南大学酿造微生物学与应用酶学研究室保存。

1.2 试剂与仪器

A.luteuβglⅠ基因：金唯智公司进行密码子优化并合成；引物、四环素抗生素（Tetracycline hydrochloride）：购自上海生工；PCR产物纯化试剂盒：购自康为世纪；DNA Marker、Protein Marker、高保真聚合酶PrimeSTAR：购自TaKaRa公司；MultiF Seamless Assembly Mix：购自ABclonal公司；AZCLCurdlan：购自Megazyme公司。

AKTA蛋白质纯化仪：GE公司；PCR仪、酶标仪、电泳仪：BIO-RAD公司；紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司。

1.3 培养基

LB培养基：氯化钠1 g/dL，蛋白胨1 g/dL，酵母浸粉0.5 g/dL。

TB培养基：蛋白胨1.2 g/dL，酵母浸粉2.4 g/dL，K2HPO4·3H2O 1.64 g/dL，KH2PO40.23 g/dL，甘油0.5 g/dL。

1.4 基因克隆与重组表达系统的构建

采用MultiF Seamless Assembly Mix试剂盒通过无缝克隆技术将密码子优化的βglⅠ基因连接到pNSWP载体上，构建获得重组质粒pNSWP-βglⅠ，该质粒在大肠杆菌中表现出氨苄青霉素抗性，在枯草芽孢杆菌中表现出四环素抗性。βglⅠ基因位于该载体上枯草芽孢杆菌α淀粉酶启动子PamyE以及amyE信号肽下游，从而进行分泌表达。将测序正确的重组质粒从大肠杆菌JM109中提取、纯化后，采用化学转化法转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，涂布在LB（+Tetracyclines 20μg/mL）平板上，挑取阳性单克隆，PCR验证，获得重组菌株WB600/pNSWP-βglⅠ，以空载体转化菌株WB600/pNSWP为阴性对照。采用无缝克隆技术构建各个突变质粒，并构建相应突变菌株。

1.5 重组菌株的发酵以及βglⅠ的表达

将重组菌株划线于LB平板（+Tetracycline 20 μg/mL）上培养12 h后，将单个菌落接种到5 mL LB培养基中，在37℃、200 r/min摇床中培养9～10 h。吸取2.5 mL种子液接种于50 mL TB培养基中，添加四环素至终质量浓度为20μg/mL。将摇瓶置于37℃、200 r/min条件下培养，每隔6 h取样测定发酵样品的相关参数，包括OD600、酶活、SDS-PAGE。

1.6 亲和层析纯化βglⅠ

在βgl I蛋白质的C端添加6 His纯化标签，摇瓶发酵48 h后收集发酵液，然后采用60%饱和度、pH 8.0的硫酸铵溶液于0℃浓缩沉淀粗酶液4～5 h。收集蛋白质沉淀并用pH 8.0 Tris-HCl（20 mmol/L）缓冲液透析处理，用Ni2+亲和层析柱纯化βgl I。纯化的βgl I置于终体积分数为10%的甘油中，液氮速冻后于-80℃保存。

1.7 βglⅠ酶活测定

βglⅠ酶活测定方法参照Brumm P的方法[9]。反应体系由5 mg AZCL-Curdlan[10-12]底物、490μL pH 6.0（100 mmol/L）磷酸钾缓冲液以及10μL酶液组成，在50℃、1 000 r/min下反应10 min。反应结束后立即加入50μL HCl（4 mol/L）终止反应，吹吸混匀后冰浴2 min。然后于12 000 r/min离心3 min，收集上清液，取200μL上清液于96孔板中，使用酶标仪测定A590。将10μL酶液替换为缓冲液作为空白对照。

单位酶活U定义为，在50℃及pH 6.0条件下，使5 mg AZCL-Curdlan底物溶液的上清液在590 nm处吸光值每分钟增加0.1所需要的酶量为一个单位（U）。

式中：△A为样品上清液A590减去空白对照上清液A590；V为反应酶液体积，mL；t为反应时间，min。

1.8 最适温度及最适pH值的测定

参照1.7酶活测定方法，测定纯化的酶溶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、80℃下的酶活，确定βglⅠ的最适反应温度。

参照1.7酶活测定方法，在最适反应温度下测定纯化的酶溶液在pH 4.0、pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 9.0的酶活，确定βglⅠ的最适反应pH值。

1.9 温度稳定性及pH值稳定性的测定

参照1.7酶活测定方法，探究βglⅠ的温度稳定性和pH值稳定性。

温度稳定性测定：将纯化的酶溶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、80℃下孵育30 min后，在最适温度及最适pH条件下测定残余酶活。

pH值稳定性测定：将纯化的酶溶液在pH 4.0、pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 9.0的缓冲液中4℃孵育6 h后，在最适温度及最适pH值条件下测定残余酶活。

1.10 金属离子对酶促反应的影响

参照1.7酶活测定方法，在酶活力测定反应体系中分别加入K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+至终浓度为5 mmol/L，然后在最适反应条件下测定酶活。所选金属盐为KCl、CaCl2、MgSO4、MnSO4·H2O、CuSO4、ZnSO4·7H2O。为防止金属离子与缓冲液产生离子沉淀反应，使用pH 6.0（100 mmol/L）柠檬酸缓冲液代替磷酸缓冲液配制各反应体系。

2 结果

2.1 重组酶在枯草芽孢杆菌中的表达

在WB600/pNSWP-βglⅠ表达体系中，βglⅠ基因由枯草芽孢杆菌α淀粉酶启动子PamyE启动转录表达。参照培养方法1.5进行WB600/pNSWP-βglⅠ摇瓶培养，发酵60 h后结束，发酵趋势见图1。在WB600/pNSWP-βglⅠ发酵24 h后，βglⅠ表达量开始增加；48 h时酶活可达195 U/mL；60 h时OD600开始下降，但酶活持续增高。

图1 WB600/pNSWP-βglⅠ摇瓶发酵曲线Fig.1 Fermentation curves of WB600/pNSWP-βglⅠin shake flask

2.2 信号肽对βglⅠ表达的影响

在本研究中，采用半理性筛选的方法选择表1中10条信号肽，替换载体上初始信号肽SPamyE（SP0），分别包括Tat分泌类型和Sec分泌类型信号肽。

表1 枯草芽孢杆菌中的表达信号肽Table 1 Signal peptides expressed in Bacillus subtilis

在发酵48 h时取样测定各菌株的酶活与生物量，以出发菌株SP0（WB600/pNSWP-βglⅠ）为对照。在生物量生长上除SP10生物量偏高，各菌株无明显差异。SP1和SP10导致重组βglⅠ未表达，SP4与SP9的酶活显著提高，前者为Tat分泌类型，后者属于Sec分泌类型。相较于出发菌株SP0酶活195 U/mL，以SP4为信号肽酶活提高了40%，以SP9为信号肽酶活提高了33%，见图2。在本研究中，Tat分泌类型的SP4（LipA）更有利于βglⅠ在WB600表达系统中表达，该重组菌株命名为WB600/pNSWPSPLipA-βglⅠ。

图2 信号肽对βglⅠ在WB600中表达的影响Fig.2 Effect of signal peptide on the expression ofβglⅠin WB600

2.3 RBS及5′UTR对βglⅠ表达的影响

RBS（Ribosome-Binding Site，RBS）序列优化以及5′UTR（5′Untranslated region，5′UTR）序列优化均在pNSWP-SPLipA-βglⅠ质粒基础上构建。RBS序列在翻译上影响目的蛋白质的表达量。在枯草芽孢杆菌中，RBS序列中的核心区SD（Shine-Dalgarno，SD）序列大多符合“AAGGAGG”序列特点[18-19]，该序列与16S rRNA 3′末端反向互补，其中启动子PgsiB下游的RBS被认为是已知枯草芽孢杆菌翻译强度非常强的天然RBS序列[20-21]。设计6条RBS序列替换载体上初始RBSamyE（R0）序列，见表2。5′UTR序列对mRNA的稳定性有一定影响。研究表明，若5′UTR含有茎环结构，且游离核苷酸较少，则更有利于mRNA的稳定，半衰期则更长[22]。选择5′末端含有茎环结构且半衰期大于20 min的5′UTR序列：sp82、aprE、cry3A，替换载体上初始amyE 5′UTR，其中sp82和cry3A 5′UTR上游接PamyE上分解代谢物操纵子amyO[24]序列，下游接初始RBSamyE（R0）序列；aprE 5′UTR替换amyE 5′UTR全部序列，见表3。对照为出发菌株上amyE 5′UTR，经查阅其半衰期仅为5 min[23]。

表2 枯草芽孢杆菌相关RBS序列Table 2 Related RBS sequences of Bacillus subtilis

表3 枯草芽孢杆菌相关5’UTR序列Table 3 Related 5′UTR sequences of Bacillus subtilis

以SP0（WB600/pNSWP-βglⅠ）为出发菌株作为实验对照，48 h发酵结束，RBS优化结果见图3。其中R3比出发菌株高120 U/mL，但与SP4（WB600/pNSWP-SPLipA-βglⅠ）相比仅高出40 U/mL，即高出约0.15倍，表达优势不明显。R1为将RBSamyE的SD序列突变为与16S rRNA 3′末端严格反向互补序列“AAAGGAGG”，结果反而导致蛋白质表达量下降。R4、R5、R6为“RBS Calculator v2.1”（https：//salislab.net/software/design_rbs_calcu-lator）[18，28]以最高翻译强度优化的不同长度的RBS序列，但对于βglⅠ的表达量无明显提高。

图3 RBS序列对βglⅠ在WB600中表达的影响Fig.3 Effect of RBS sequence on the expression ofβglⅠin WB600

5′UTR序列均选择天然序列，替换初始amyE 5′UTR，发酵48 h结束，结果见图4。sp82和aprE 5′UTR序列均导致βglⅠ表达量下降，反之，cry3A 5′UTR对于βglⅠ在枯草芽孢杆菌中的表达贡献极大，比SP4（WB600/pNSWP-SPLipA-βglⅠ）酶活高出169 U/mL，比出发菌株SP0（WB600/pNSWP-βglⅠ）高出249 U/mL，约1.2倍。SDS-PAGE结果见图5，βglⅠ相对分子质量大小在57 000左右[14]，pNSWPcry3A-SPLipA-βglⅠ在该位置条带比对照pNSWP-βglⅠ粗。

图4 5′UTR序列对βglⅠ在WB600中表达的影响Fig.4 Effect of 5′UTR sequence onβglⅠexpression in WB600

图5 βglⅠSDS-PAGE图谱Fig.5 SDS-PAGE profile ofβglⅠ

2.4 βglⅠ的酶学特性分析

最适温度和温度稳定性的测定结果见图6，以最高比活为100%。βglⅠ在50℃左右显示出最高比活；温度超过60℃时，不再利于βglⅠ的酶促反应；低于45℃条件下孵育30 min对βglⅠ酶活影响较小；但在50℃条件下孵育30 min，酶活开始有明显下降；55℃孵育30 min后，βglⅠ接近于彻底失活。

图6 βglⅠ的最适反应温度和温度稳定性Fig.6 Optimum reaction temperature and temperature stability ofβglⅠ

最适pH和pH稳定性的测定结果见图7。βglⅠ的最适pH值在6.0左右，最适反应条件下比活约为973 U/mg。酶活在pH 5.5～6.5较高，该酶的稳定性较强，在pH 4.0～9.0孵育6 h后，依然有80%以上残余酶活。

图7 βglⅠ的最适pH值和pH值稳定性Fig.7 Optimum pH and pH stability ofβglⅠ

近期研究发现，许多糖苷水解酶含有βγ-结构，该结构具有Ca2+结合位点，这表明Ca2+对于糖苷水解酶的酶促反应具有一定贡献[29-30]。因而作者研究了K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+6种金属离子对βglⅠ的酶活影响[30]，结果见图8。与不添加任何金属离子的对照相比，6种金属离子对βglⅠ的酶促反应无明显影响。

图8 金属离子对βglⅠ酶促反应的影响Fig.8 Effect of metal ions onβglⅠenzymatic reaction

3 讨论

藤黄节杆菌来源的βglⅠ在裂解酵母制备酵母抽提物中具有突出的优势。然而，βglⅠ在生产中存在野生型或外源表达水平低的问题，且还未有报道其在枯草芽孢杆菌中表达。本研究采用食品级安全菌株枯草芽孢杆菌表达βglⅠ，并通过优化表达元件来提高βglⅠ的产量，对拓展βglⅠ在食品、饲料中的应用具有重要意义。

在本研究中，采用了较强组成型启动子PamyE以及amyE信号肽将βglⅠ在WB600中进行分泌表达，进一步通过优化信号肽、RBS和5′UTR提高了βglⅠ的表达量。信号肽决定新合成蛋白质的分选、转运，对于目的蛋白质在异源宿主中的表达也有一定影响。研究发现，信号肽具有如下特征能够更加有效地促进蛋白质分泌，如含有带正电荷更高的N-结构域，更疏水的H-结构域和更保守的C-结构域[31-32]。作者比较了11条信号肽，结果显示，Tat分泌类型的SP4（LipA）与Sec分泌类型的SP9（Mpr）能够提高βglⅠ的胞外表达水平，发酵上清液中粗酶酶活比出发菌株SP0分别高0.4倍和0.3倍，这两条信号肽的N-结构域正电荷数和H-结构域疏水性都处于较高水平。CAZY数据库（http：//www.cazy.org/GH64_characte-rized.html）中表明βglⅠ蛋白质通过Tat分泌途径分泌至胞外环境中，在本研究中，Tat分泌类型的信号肽SP4（LipA）更有利于βglⅠ在枯草芽孢杆菌WB600宿主中表达，这可能与βglⅠ属于Tat分泌途径蛋白质有关。

RBS是翻译起始和蛋白质表达的关键控制元件[28]。在本研究中，初始RBS采用了PamyE下游的RBS序列“AATAAGGAGTGT”，为了增强翻译强度从而提高目的蛋白质的表达量，比较了7条RBS序列的表达效果。结果显示，R3（RBSgsiB）表达量最高，粗酶酶活比出发菌株SP0高0.61倍。这可能是因为RBSgsiB的SD序列“5′-AAAGGAGG-3′”与16S rRNA 3′末端“3′-UUUCCUCC-5′”相互作用强度高，且距离翻译起始位点ATG具有最佳的9 bp间隔。RBSgsiB被认为是枯草芽孢杆菌中翻译强度非常强的天然RBS序列[20]。

5′UTR元件与mRNA的稳定性密切相关，从而影响目的蛋白质的表达量。在本研究中，amyE 5′UTR被用作初始5′UTR序列。据报道，该序列引导的amyE mRNA半衰期为5 min[23]。为了提高mRNA的稳定性，从而提高βglⅠ的表达量，作者比较了4条5′UTR序列。结果显示，cry3A 5′UTR更有利于βglⅠ的表达，与出发菌株相比酶活提高了1.2倍。据文献报道，cry3A 5′UTR引导的mRNA半衰期为20 min，其5′末端含有与翻译起始无关的SD序列“GAAAGGAGG”，该序列与16S rRNA 3′末端严格反向互补，是其稳定性的关键因素[33]。

βglⅠ的酶学特性研究较少，目前仅在最适pH以及底物特异性方面有相关报道[4]。作者对βglⅠ在温度、pH、金属离子影响等方面进行了研究。结果显示，βglⅠ在50℃下显示出最高酶活，在低于40℃下稳定性较强。以往报道中并未探究βglⅠ的最适反应温度，测定活性时将βglⅠ置于37℃条件下反应，然而37℃下βglⅠ的酶活显示较低[4-5，14，34]。其他内切β-1，3-葡聚糖酶也多在50℃左右显示最高酶活[30，35-37]。βglⅠ的最适反应pH值在6.0左右，这与已报道的βglⅠ的葡聚糖酶活性最适pH相符合[4]。βglⅠ在pH 4.0～9.0显示出较高的pH稳定性，孵育6 h后依然具有大于80%的残余酶活。其他内切β-1，3-葡聚糖酶也在pH 4.0～9.0条件下具有大于80%的残余酶活[30，35]。