烟草合子时期特异表达基因的克隆与分析

罗岸

摘要：在烟草合子中克隆到1种新型的未知功能基因NtZE583，编码包含有91个氨基酸残基的多肽链。生物信息学分析显示：该蛋白的N端含有1段疏水性信号肽，但在其他物种中没有发现同类蛋白。NtZE583-绿色荧光蛋白（NtZE583-GFP）融合蛋白亚细胞定位显示，该蛋白可能存在于液泡中。利用染色体步移技术获得该基因5′端上游3 866 bp的侧翼序列（启动子和5′UTR），经检测发现，具有较强的启动子活性。研究结果为进一步研究该基因在烟草早期胚胎发生中的功能奠定了基础。

关键词：烟草；合子；液泡；基因克隆；信号肽

中图分类号： S572.01；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0065-04

被子植物的受精过程被称为双受精，即来自同一花粉的2个精子同时进入胚囊，1个与卵细胞结合形成二倍体的合子，另2个与中央细胞结合形成三倍体的胚乳母细胞。受精完成后，胚胎逐渐形成基本的形态和生理结构[1]，而胚乳则在此过程中扮演支持者的角色[2-3]。

对于受精和早期胚胎发生过程的分子机制在动物中研究得比较深入，但是在植物中由于技术手段的限制导致对这方面的认识一直有许多空白。因为植物的受精和胚胎发生过程都存在于深埋在植物孢子体内的胚囊中，所以很难对整个过程直接进行观察并了解背后的分子机制。随着现代生物学技术的发展，目前已能获得玉米、拟南芥、大米、大麦等一些植物的配子、合子和早期胚胎；此外，这些植物中与生殖发育息息相关的细胞cDNA文库、转录谱等也已陆续获得[4-7]。这些进展对于研究植物的受精和胚胎发生过程起到了推动作用。

为了探索受精和早期胚胎发生的分子机制，特别是早期胚胎发生中的表观调控机制、合子不等分裂、细胞间通信等重大问题，笔者所在实验室用前期建立的胚胎分离技术[8-9]和SMARTTM cDNA library construction试剂盒构建了烟草合子和卵细胞的cDNA差减文库，通过筛选获得了许多在合子时期特异表达的基因[10]。对其中1个具有信号肽结构的未知基因NtZE583进行克隆和染色体步移，获得了其完整CDS序列和有活性的5′侧翼调控序列，为进一步利用基因敲除和过表达技术来研究其在烟草早期胚胎发育中的作用打下基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株与质粒绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白表达载体，GFP核定位表达载体在pART27载体上改造而成，由武汉大学彭雄波副教授提供。大肠杆菌DH5α感受态为笔者所在实验室自制。

1.1.2植物材料试验材料为野生型烟草（Nicotiana tabacum var. SR1），种植于长江大学生命科学学院所属温室内，室温25 ℃，光照时间16 h。

1.1.3主要试剂普通DNA片段回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）；DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN公司）；Universal Genome Walker Kit（Clontech公司）；DNA聚合酶Ex Taq（TaKaRa公司）；DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerasehe、限制性内切酶（NEB公司）；T4 DNA lignase（Fermentas公司）；Dynalbeads mRNA DIRECT Micro Kit（Life technologies公司）；SMARTerPico PCR cDNA Synthesis Kit（Life technologies公司）。

1.2试验方法

1.2.1烟草genome walking文库的构建和NtZE583基因5′ 侧翼区的克隆取烟草幼叶，按照DNeasy Plant Mini试剂盒的要求提取DNA。用UniversalGenomeWalker试剂盒构建genome walking 文库，检测合格后按照试剂盒要求设计GSP引物。反应体系和反应条件参照试剂盒要求，引物退火温度灵活掌握，得到目的片段后送样测序，引物序列详见表1。

1.2.2烟草合子的分离与少量细胞RT-PCR用酶解-研磨法分离得到50个烟草合子[8-9]。按照Dynalbeads mRNA DIRECT Micro试剂盒的说明分离出合子的mRNA，并使用SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis试剂盒制成合子cDNA库。在已知EST序列2端设计检测引物扩增 NtZE583 基因CDS序列，扩增产物经电泳检测正确后送样测序，引物序列详见表2。

1.2.3NtZE583-EGFP融合蛋白和EGFP核定位表达载体的构建依据已知序列，分别设计用于扩增NtZE583基因的5′ 侧翼区和CDS的引物，并在5′端添加酶切位点，引物序列见表3。用CDS-F2/CDS-R2引物，在烟草合子cDNA库中扩增CDS序列；用PRO-F/PRO-R在烟草基因组中扩增NtZE583基因侧翼序列（启动子和5′UTR）。对目的条带回收后进行双酶切，并分别连入NtZE583-GFP融合蛋白表达载体、GFP核定位表达载体。

表3载体构建所需引物

1.2.4NtZE583-GFP融合蛋白亚细胞定位和NtZE583启动子活性的观察应用基因枪法将构建好的NtZE583-GFP融合蛋白表达载体和EGFP核定位表达载体转导入洋葱表皮细胞，培养24 h后用普通荧光显微镜观察。

1.2.5生物信息学分析用Omiga分析EST序列的开放阅读框。用Protparam、ProtScale软件预测蛋白质的氨基酸组成和理论等电点等基本理化性质，并通过SOPMA软件预测其二级结构。分别用PSORT、SignalP软件预测蛋白质的亚细胞定位和信号肽。

2结果与分析

2.1烟草早期胚胎的分离

植物的胚胎发育过程发生在母体组织中。由于母本组织的干扰，通常难以有效地获取正在发育的胚胎细胞。目前通过酶解和显微操作已经能够精确地分离出烟草SR1胚珠中合子发育时期的胚囊（图1-A）。合子为胚囊细胞所包裹，必须进行2次酶解和显微操作才能获得未附带母体组织的完整的合子（图1-B）。图1结果显示：经过酶解和显微操作分离后的合子形态正常，背景清晰无杂质，这说明分离的合子状态良好且无母体组织污染，可以用于后续少量细胞mRNA的提取和cDNA库的制作。

2.2NtZE583基因在合子中的检测

根据笔者所在实验室之前获得的烟草合子cDNA 文库信息，已知烟草合子中存在NtZE583基因的表达。NtZE583基因EST序列长度为449 bp，Omega软件分析显示，该基因拥有1个273 bp的开放阅读框，可以在合子cDNA库中得到扩增（图2）。经过NCBI数据比对发现，尚无类似基因存在于其他物种中，表明NtZE583基因属于1个未知功能的、在早期胚胎发育时期表达的新型基因。

2.3NtZE583蛋白一级结构预测分析

运用软件对NtZE583蛋白进行生物信息学分析，结果显示：NtZE583蛋白的分子量为9.785 3 ku，理论等电点为 8.46，属于碱性蛋白。该蛋白多肽链包含91个氨基酸残基，含18 种基本氨基酸类型，不含组氨酸、色氨酸，其中丝氨酸含量最高，占16.5%。氨基酸一级结构预测分析表明：NtZE583蛋白拥有8个正电荷残基、5个负电荷残基，该蛋白脂肪系数为72.86，不稳定性指数为50.07，平均总疏水性为0.286，预测为疏水性蛋白，且不太稳定（表4）。

2.4NtZE583蛋白二级结构的预测

蛋白质多肽链自身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象称为蛋白质二级结构，α-螺旋、β-转角等属于蛋白质的基本二级结构。正确的二级结构有助于蛋白质正常履表4NtZE583基因编码的氨基酸一级结构预测分析结果行其在细胞生命活动中的功能。 软件分析显示，NtZE583蛋白的二级结构有3种形式，分别为α-螺旋、无规则卷曲、延伸链，分别占18.68%、52.75%、28.57%）。图3结果显示，无规则卷曲这类二级结构在NtZE583蛋白中最多，α-螺旋主要集中在蛋白的N端，而延伸链则在蛋白中零星分布（表5、图3）。

2.5NtZE583蛋白信号肽的预测与蛋白亚细胞定位的分析

用Psort软件对NtZE583蛋白亚细胞分布进行预测，发现最可能分布在膜外。同时用ProtScale软件预测NtZE583蛋白N端的氨基酸发现，其具有较强的疏水性；用SignalP软件预测NtZE583蛋白发现可能存在信号肽，并在第24、第25个氨基酸之间剪切（图4）。为了进一步分析NtZE583蛋白的亚细胞定位，采用融合蛋白载体瞬时转化洋葱表皮细胞。由图5可以看出：35S启动子驱动的GFP蛋白在细胞中均匀分布，而35S启动子驱动的NtZE583-GFP融合蛋白则主要分布在细胞质的液泡中，暗示NtZE583蛋白的亚细胞定位受其N端的信号肽控制。

2.6NtZE583基因的5′侧翼序列在早期胚胎时期的活性

以EST序列为基础，通过染色体步移技术共获得NtZE583基因起始密码子ATG前共3 866 bp的侧翼序列。为验证其启动活性，扩增了其中的2 725 bp（包括部分启动子、全部5′UTR序列）接入GFP核定位载体，采用基因枪将载体注射入洋葱表皮细胞中进行观察。荧光显微镜中可以看到，洋葱表皮细胞的细胞核中有清晰可辨的绿色荧光（图6），表明所获基因的5′侧翼序列确实具有较强的启动子活性。

3讨论

在烟草合子中表达的NtZE583基因含有273 bp的CDS区，其编码的蛋白质作为一种未知功能的新型蛋白，在NCBI数据库收录的双子叶和单子叶植物的基因信息中均未发现，其可能在烟草合子的发育过程中起着某种独特的作用。对新获得的NtZE583蛋白序列进行分析表明，该蛋白具有信号肽；将NtZE583蛋白与GFP蛋白融合后在洋葱表皮细胞中观察其亚细胞定位，发现它极有可能定位于细胞的液泡中。

植物细胞相对于动物细胞而言，普遍含有液泡这一特殊的细胞器[11-13]。液泡由单层质膜包围而成并充满液体，与植物细胞的各种重要的生命活动息息相关，如参与细胞渗透压和膨压的维持与调节、帮助稳定细胞内pH值、消除由某些有毒物质导致的毒害作用、存储营养物质及其多种代谢产物、保证细胞生物合成原料的稳定供应等。

NtZE583基因的发现表明，在烟草合子的发育过程中有一种独特的未知功能的蛋白存在于液泡中并发挥了重要作用。本研究利用染色体步移技术对NtZE583基因的5′侧翼序列进行了克隆，将包括启动子、5′UTR区的序列连接GFP后瞬时转化洋葱表皮细胞，能观察到极强的绿色荧光。说明获得的表达调控序列具有较强的启动子活性，为今后使用RNA干扰（RNAi）和过表达等基因功能分析手段对NtZE583基因在合子发育中的功能进行研究提供了帮助，将丰富我们对植物早期胚胎发生过程中的分子调控机制的认识。

4结论

本试验成功克隆了烟草合子表达基因NtZE583，并获得了具有启动子活性的5′侧翼序列，为阐明NtZE583基因参与早期胚胎发生的机制奠定了基础。

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