归芪多糖延缓大鼠脑组织衰老的作用机制

张凯丽，陈 博，田昌义，张 琦，张九洲，雷李涛，蒲秀瑛

（兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

脑老化是人类机体老化的突出表现之一[1]，脑组织衰老会发生一系列特征性改变，包括神经细胞萎缩，脑细胞数减少，脂褐素沉积增多，细胞间突触数量减少等[2]；脑衰老与脑梗死、阿尔兹海默症帕金森病等疾病的发生有密切联系。因此，了解脑衰老的机制及如何延缓脑衰老对预防一些疾病具有重要意义。本研究所用归芪多糖是通过水提醇沉的方法从经典验方“当归补血汤”而来，其主要原料当归与黄芪是我国传统的药食同源中药，有悠久的药用历史。研究表明，归芪多糖可增强抗氧化活性和免疫功能[3]，通过调控细胞周期来降低P53和P16蛋白质的表达[4]，增加CyclinD1和SIRT1蛋白质的表达[5]来延缓细胞的衰老。因此，作者以D-半乳糖诱导建立大鼠衰老模型，研究归芪多糖延缓大鼠脑组织衰老的机制，为归芪多糖的进一步开发利用提供理论基础，使其在食品工业中具有广阔的开发应用前景。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

健康SD大鼠60只：购自中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证编号：SYXK（甘）2019-0001，体质量约180 g，雌雄各半，在SPF级别环境适应性饲养一周，实验操作遵守实验动物伦理委员会规定；GQP：作者所在实验室从当归（Angelica sinensis）和黄芪（Astragalus membranaceus）中提取（当归∶黄芪质量比为1∶5）；D-gal、白藜芦醇：购自阿拉丁试剂公司；总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒、ATP测定试剂盒：南京建成生物公司研究所提供；BCA蛋白质浓度测定试剂盒、罗丹明123：购自碧云天生物试剂；兔SP试剂盒、DAB显色试剂盒：购自中杉金桥。

1.2 仪器

台式电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏设备公司制造；包埋机：浙江省金华市科迪仪器制造；切片机：LEICA2016，德国制造；恒温水浴锅：HH-S4，北京科伟永兴仪器有限公司制造；酶标仪：INFINITE M PLEX，Tecan公司制造；流式细胞仪：AccuriTM C6 Plus，BD公司制造；超低温离心机：TGL16E，长沙英泰仪器有限公司制造。

1.3 动物分组及造模

60只大鼠随机分为6组，对照组（Control组）、模型组（Model组）、归芪多糖低剂量组（LP组）、归芪多糖中剂量组（MP组）、归芪多糖高剂量组（HP组）、白藜芦醇组（Res组）。除对照组外，其他组大鼠每日颈背部皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg）（无菌条件下，用生理盐水配制成150 mg/mL的D-半乳糖），同时LP组、MP组、HP组和Res组每天分别灌胃给予归芪多糖0.5、1、2 g/kg（用蒸馏水配制50、100、200 mg/mL的溶液）和白藜芦醇100 mg/kg（配制成10 mg/mL的溶液）；对照组给予等量的生理盐水，连续给药6周。

1.4 行为学观察

造模期间观察并记录各组大鼠的体征及行为变化。

1.5 脑组织病理变化观察

治疗结束后，解剖大鼠，取大鼠脑组织，用预冷的生理盐水清洗干净，切取一半用体积分数10%甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋、切片并进行HE染色，在光学显微镜下观察各组大鼠脑组织病理学形态变化。

1.6 脑组织中T-SOD、MDA、GSH、ATP的测定

称取脑组织0.2 g，制成10%的组织匀浆，按照T-SOD、MDA、GSH、ATP测定试剂盒说明书测定脑组织中T-SOD、MDA、GSH、ATP水平。

1.7 脑组织线粒体膜电位测定

线粒体制备：称取漂洗干净的脑组织0.2 g于玻璃匀浆器中，加入9倍体积预冷的质量分数0.86%的生理盐水，将匀浆器放置在盛有冰水混合物的器皿中充分研磨（6~8 min），使组织匀浆化，2 000 r/min离心10 min，弃沉淀，4℃条件下上清液以9 500 r/min离心15 min，沉淀即为线粒体。用BCA法测定线粒体蛋白质质量浓度。线粒体用PBS洗涤两次，3 000 r/min离心10 min，加入10 mg/L罗丹明123 0.5 mL，37℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测各组线粒体膜电位变化（E x＝488 nm；E m＝530 nm）。

1.8 脑组织线粒体膜肿胀度测定

按照1.7中的方法提取脑组织线粒体，配制反应缓冲液（蔗糖250 mmol/L，磷酸二氢钾5 mmol/L，琥珀酸钠3 mmol/L，氯化钙0.3 mmol/L，pH7.2），调整线粒体蛋白质质量浓度为0.5 mg/mL，于520 nm处测定OD值，记录0、2、4、6、8、10、20 min时的A520nm值，以吸光度的下降值表征线粒体的肿胀程度。

1.8 免疫组化分析Bcl-2、Bax的表达

厚度为10μm石蜡切片，脱蜡，水化，用体积分数3%的过氧化氢封闭，孵育兔源的抗Bax和Bcl-2的抗体（1∶100），滴加羊抗兔IgG，DAB显色，显微镜下观察，显示为棕黄色时终止反应，酒精梯度脱水，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

1.9 统计学方法

统计分析采用Graph Pad Prism 5.0进行方差分析，所有数据以“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 行为学变化

对照中大鼠行动敏捷，毛色光亮，精神状态良好，模型组大鼠，行动变迟缓，背部毛发变黄，变粗，掉毛，嗜睡，精神状态较差。各GQP组和Res组大鼠较模型组活动多，毛发脱落较少，精神状态佳。

2.2 脑组织病理学变化

HE染色结果见图1。对照组大鼠脑组织形态结构清晰，神经元细胞排列较整齐，密集；模型组大鼠海马区轮廓模糊，神经元细胞密度降低，排列稀疏，细胞间质变大；GQP组和Res组大鼠上述病理变化均有一定程度的改善。

图1 各组大鼠脑组织HE染色Fig.1 HE staining of rat brain tissues in each group

2.3 脑组织中T-SOD、MDA、GSH、ATP水平

各组大鼠脑组织中T-SOD、MDA、GSH、ATP比较结果显示，模型组中T-SOD、GSH、ATP水平较正常组有所降低，MDA质量摩尔浓度升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，各GQP组和RES组中T-SOD、GSH、ATP水平升高，MDA质量摩尔浓度降低，差异有统计学意义（P<0.05），结果见图2。

图2 GQP影响衰老大鼠脑组织中的SOD、MDA、GSH活性以及ATP水平Fig.2 Activities of SOD,MDA,GSH and ATP levels in the brain tissue of aging rats affected by GQP

2.4 脑组织线粒体膜电位变化

线粒体膜电位测定结果见图3~4。对照组中荧光强度较弱，线粒体膜电位较高，模型组中荧光显著增强（Rhl123+增加），线粒体膜电位去极化程度增强，线粒体膜电位降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；而各GQP组和Res组，荧光强度降低，线粒体膜电位显著升高（P<0.05）。

图3 线粒体膜电位测定结果Fig.3 Mitochondrial membrane potential measurement results

2.5 脑组织线粒体膜肿胀度变化

对照组中A520nm降低较慢，模型组中吸光度下降快。与对照组相比，模型组大鼠脑组织线粒体膜的肿胀度显著增加（P<0.01）；与模型组相比，GQP组和Res组线粒体膜的肿胀度降低（P<0.01），见图5。

图5 线粒体肿胀度Fig.5 Mitochondrial swelling

2.6 Bcl-2和Bax的表达

免疫组化结果显示，Bcl-2和Bax蛋白质阳性信号显示为棕黄色，对照组中可见大量的Bcl-2阳性细胞，模型组中有少量的Bcl-2阳性细胞，Bcl-2的表达显著降低（P<0.01）；而GQP组和Res组中Bcl-2阳性细胞较模型组中多，Bcl-2蛋白质的表达增加（P<0.05）。对照组中Bax阳性细胞数量较少，模型组中Bax阳性细胞显著增加，Bax的表达显著增加（P<0.01）；但是，GQP组和Res组中可见少量的Bax阳性细胞，Bax蛋白质的表达显著降低（P<0.05），见图6~7。

图6 Bcl-2免疫组化图和Bax免疫组化图Fig.6 Immunohistochemistry of Bcl-2 and Bax

3 结 语

衰老是引起许多非传染性急病、慢性疾病的因素之一，主要包括充血性心力衰竭、老年痴呆、心脑血管疾病、糖尿病和癌症等。如何延缓衰老、提高人类健康是当今研究的热点之一，也是整个生命科学研究面临的挑战。研究报道，内源性抗氧化酶SOD、MDA、GSH等是组织氧化应激的指示剂，决定了机体抗氧化损伤的能力[6]。SOD是机体内存在的超氧自由基清除因子，能够减轻氧自由基对机体的损害，从而延缓衰老[7]；MDA是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的主要降解产物，可以反映机体过氧化的程度；GSH具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等生物功能。本研究结果显示，GQP提高了大鼠脑组织中SOD和GSH水平，降低了MDA的质量摩尔浓度，表明GQP可能通过提高机体的抗氧化能力来降低自由基对机体的损害，从而发挥其延缓衰老的作用。

图4 线粒体膜电位Fig.4 Mitochondrial membrane potential

ATP又称为三磷酸腺苷，作为细胞内能量传递的“能量通货”，用来储存和传递化学能，为细胞各项生命活动的供应能量。因此ATP的含量可用于衡量细胞代谢相关的生命活动，是衡量细胞衰老的最重要指标之一[8]。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供了能量，细胞生命活动所需的能量95%来自线粒体，所以称之为“细胞动力工厂”。有研究表明，衰老细胞中的形态与功能发生明显的变化，主要表现为线粒体膜肿胀程度增加，跨膜电位降低[9-10]。据报道，白藜芦醇可通过保护线粒体功能来延缓MSC的衰老[11]。线粒体膜电位的降低可以使线粒体能量产生障碍，能量代谢障碍是内皮细胞衰老的机制之一[12]。本研究结果显示，GQP升高了大鼠脑组织中ATP质量摩尔浓度，同时GQP提高了脑组织线粒体膜电位变化，降低了线粒体膜肿胀程度。罗阿苗[5]等的研究也表明，GQP通过改善线粒体结构功能从而延缓细胞衰老，与本研究结果一致。

图7 Bcl-2和Bax的表达结果Fig.7 Expression results of Bcl-2 and Bax

Bcl-2家族中有的可以抑制凋亡（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等），有的可以促进细胞凋亡（Bax、Bak、Noxa等）。B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因是公认的长寿基因之一，大多位于线粒体外膜上，具有明显抑制细胞凋亡的作用。当Bcl-2的表达增强时，细胞的存活期则延长，抑制细胞凋亡。Bax基因是最主要的凋亡基因之一，编码的Bax蛋白质可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。研究表明，P53的过表达可以激活下游靶蛋白Bax的表达，抑制Bcl-2的表达，从而导致细胞凋亡[13-14]。过度表达的Bcl-2能抑制线粒体通透性改变，并影响巨孔的形成，从而抑制凋亡。本研究的结果表明，GQP增加脑组织中Bcl-2蛋白质的表达，减少Bax蛋白质的表达。上调Bcl-2/Bax比值，可使线粒体膜电位降低，减弱了线粒体膜的肿胀，从而改善细胞衰老，这与林文弢等[15]的研究结果一致。

综上所述，GQP可能通过减轻脑组织的氧化损伤来改变其线粒体的功能，调节Bcl-2和Bax蛋白质的表达，从而发挥延缓衰老的作用，此研究结果为GQP的进一步应用提供科学依据。