基于代谢组学的不同年份晒青红茶化学成分分析

陈 丹，赵燕妮*，彭佳堃，高健健，林 智，陈雪峰，周长锋，戴伟东,*

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.中国农业科学院茶叶研究所，农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008；3.陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710021；4.临沧益峰茶业有限公司，云南 临沧 530900）

红茶作为一种全发酵茶，是我国六大茶类之一，因其独特的香气和滋味品质风靡全球，目前红茶占世界茶叶生产量、贸易量和消费量的70%以上[1]。红茶含有多种功能性成分，对人体具有良好的保健作用。红茶中源自茶鲜叶的茶多酚具有抗炎、抗氧化、保护心肌等功效[2]。此外，红茶加工过程中，鲜叶中儿茶素类成分发生酶促氧化反应[3]形成的茶黄素具有抗菌、抗病毒、调节血脂等多种保健功能，并对红茶的滋味和汤色品质形成具有重要作用[4]。不同于传统红茶的高温干燥，晒青红茶则是采用日光自然干燥，制得的红茶茶汤橙黄明亮、香气内敛、滋味鲜醇，鲜爽度高于传统红茶，受到广大消费者的喜爱[5-6]。

近年来，茶叶市场上掀起“年份茶热”，年份白茶、年份黑茶等长时间贮藏的茶叶受到茶叶消费者的青睐。贮藏对于茶叶内含成分和风味品质具有十分重要的影响，茶叶贮藏过程中化学物质基础的变化规律已成为茶学领域的研究热点。周琼琼等[7]发现白茶在长期贮藏过程中，茶多酚、游离氨基酸、咖啡碱、可溶性糖含量均呈下降趋势，而黄酮含量明显增加。曾亮等[8]利用超高效液相色谱-质谱和分光光度计对不同贮藏时间的普洱生茶内含成分进行分析，结果表明，儿茶素、茶多酚和游离氨基酸含量随着贮藏时间的延长而逐渐降低，黄酮含量则逐渐增加，而咖啡碱和可溶性糖含量无明显变化。石玉涛等[9]发现随着贮藏时间的延长，武夷岩茶的感官品质有所下降，游离氨基酸含量随贮藏时间的延长而降低，抗氧化活性也逐渐降低。Dai Weidong等[10]利用非靶向代谢组学方法对不同贮藏时间绿茶中儿茶素类、游离氨基酸、咖啡碱、可可碱、黄酮醇-O-糖苷和黄酮-C-糖苷等进行定性定量分析，发现儿茶素类和游离氨基酸含量在绿茶贮藏过程中降低，而咖啡碱、可可碱、黄酮醇-O-糖苷和黄酮-C-糖苷含量升高。上述研究大多数仅对茶叶贮藏过程中少数种类成分进行分析。红茶市场近年来面临着供大于求的问题，部分红茶不可避免地进入贮藏阶段，因此年份红茶也受到了广泛关注，并受到部分消费者的喜爱。Huang Ai等[11]发现红茶长时间贮藏后，色、香、味均发生较大变化，茶汤颜色由亮红色逐年变暗，香气逐渐出现陈香，滋味由甜醇鲜变得醇和，苦味降低。但目前对于红茶在贮藏过程中化学成分的变化鲜有报道。

本研究利用基于超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱的代谢组学方法对贮藏时间为0、1、3 a和4 a的晒青红茶进行分析，探究晒青红茶在贮藏过程中化学成分的变化规律，旨在为消费者合理、正确认识年份红茶提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同贮藏时间（0、1、3、4 a）的晒青红茶样品由临沧益峰茶业有限公司提供，分别制作于2020、2019、2017、2016年。茶鲜叶原料采摘自云南省临沧市双江县勐库镇，按照“萎凋→揉捻→发酵→日光晒干”工艺制作成晒青红茶，当地气候条件下室温贮藏。茶样在进行代谢组学分析前，经磨碎后放入-20 ℃冰箱中保存备用。

儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素没食子酸（catechin gallate，CG）、茶氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸、缬氨酸、谷氨酸、色氨酸、苏氨酸、牡荆素、异牡荆素、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-芸香苷、山柰酚-3-芸香苷、山柰酚-3-半乳糖苷、山柰酚-3-葡萄糖苷等标准品 美国Sigma公司； 茶黄素（theaflavin，TF）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF-3-G）、茶黄素-3′-没食子酸酯（theaflavin-3′-gallate，TF-3′-G）、茶黄素-3,3′-没食子酸酯（theaflavin-3,3′-digallate，TF-DG）等标准品 武汉ChemFaces公司。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Merck公司；甲酸（＞99.0%，色谱纯） 日本TIC公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱仪（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive/MS） 美国赛默飞世尔科技有限公司；T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美国Waters公司；粉碎研磨机 德国IKA 公司；SQP电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DK-S11型电热恒温水浴锅 上海森信实验 仪器有限公司；5810R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取0.1 g茶样放入离心管中，加入20 mL体积分数70%甲醇溶液，充分溶解并放入70 ℃水中浸提30 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤[12]。每个茶叶样本均设置3个平行重复，以供后续分析。

1.3.2 UPLC-Q-Exactive/MS分析条件

晒青红茶样品代谢组学分析采用UPLC-Q-Exactive/MS系统进行数据采集。

UPLC条件：T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温40 ℃，流速0.4 mL/min，进样量3 μL。流动相：A相为体积分数0.1%甲酸-水溶液，B相为体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液。洗脱程序：0～5 min，98% A、2% B；10 min，85% A、15% B；18 min，60% A、40% B；20 min，10% A、90% B；20.9 min，10% A、90% B；21～25 min，98% A、2% B[13]。

MS条件：采用电喷雾电离（electron spray ionization，ESI）离子源，正离子模式，毛细管电压3.5 kV，毛细管温度300 ℃，辅助气温度350 ℃，辅助气流速10 L/min，质量扫描范围m/z150～2 000。

1.4 数据处理

UHPLC-Q-Exactive/MS分析得到的原始图谱采用Compound Discoverer 3.2软件进行峰匹配与峰面积提取。采用SIMCA-P 14.1软件（Umetrics，瑞典）进行有监督的偏最小二乘回归分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和载荷图绘制。采用SPSS 25软件（IBM，美国）进行单因素方差分析，用于筛选具有显著差异的化合物。热图分析由Mev 4.7.4软件（Oracle， 美国）完成[14]。

2 结果与分析

2.1 不同年份晒青红茶的内含成分分析

经峰匹配与校准后共得到1 221种化合物离子用于后续的分析。通过与标准品比较、一级质谱、二级质谱分析等，共结构鉴定出82种化合物离子（表1），包括6种儿茶素类（C、EC、ECG、EGCG、GC、表阿福豆素-3-O-没食子酸酯）、9种二聚儿茶素类（TF、TF-3-G、 TF-3′-G、TF-DG、原花青素B2、原花青素B4等）、5种氨基酸类（茶氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸等）、8种生物碱类（咖啡碱、可可碱等）、8种酚酸类（绿原酸、4-香豆酰奎宁酸等）、3种有机酸类（奎宁酸、泛酸等）、2种香气糖苷类（芳樟醇氧化物樱草糖苷、苯乙基樱草糖苷）、6种N-乙基-2-吡咯烷酮取代的儿茶素（N-ethyl-2-pyrrolidinone-substituted flavan-3-ols，EPSF）类（(S)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的EC（(S)-EC-cThea）、(R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的EC（(R)-EC-cThea）、(S)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的ECG（(S)-ECG-cThea）、(R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的ECG（(R)-ECG-cThea）、(R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的EGC（(R)-EGC-cThea）、(R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的EGCG（(R)-EGCGcThea））、20种黄酮糖苷类（牡荆素、异牡荆素、山柰酚-3-葡萄糖苷、山柰酚-3-半乳糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷等）、10种脂类（溶血磷脂酰胆碱（16:0）、甘油单酯（18:3）等）和5种其他化合物（1-乙基-5-羟基-2-吡咯烷酮、茶氨酸葡萄糖苷等）。

表1 不同贮藏时间晒青红茶中鉴定出的代谢物Table 1 Differential metabolites identified in sun-dried black tea of different ages

续表1

续表1

2.2 晒青红茶贮藏过程中内含成分变化规律

PLS-DA表明（图1A），短期贮藏（0、1 a）的晒青红茶样品与长期贮藏（3、4 a）的晒青红茶样品在第1主成分上（R2x[1]=0.394）具有明显分离趋势；贮藏0 a的晒青红茶样品与贮藏1 a的晒青红茶样品在第2主成分上（R2x[2]=0.224）具有明显分离趋势。该结果表明，晒青红茶贮藏过程中一些化合物的含量在逐步发生变化。变量投影重要性（variable importance of projection，VIP）表示PLS-DA模型中每个化合物对差异的贡献程度。VIP值越大，表示对PLS-DA模型的分类贡献越大，也表示该化合物在不同贮藏时间的含量差异越大[15-16]。结合表1并对比得分图（图1A）与载荷图（图1B）可看出，部分化合物在短期贮藏后（0、1 a）含量较高，长期贮藏（3、4 a）后含量降低（分散于载荷图左侧）；部分化合物在短期藏后（0、1 a）含量较低，长期贮藏（3、4 a）后含量升高（分散于载荷图右侧）。

图1 不同贮藏时间晒青红茶的PLS-DA图（A）和载荷图（B）Fig. 1 PLS-DA score plot (A) and loading plot (B) of sun-dried black tea of different ages

从已鉴定的化合物中筛选出在不同年份晒青红茶样品间具有显著差异（P＜0.05）的化合物，共66种，为了更清楚看出在不同贮藏时间下化合物的差异，采用MeV4.7.4软件对这些化合物进行热图分析。如图2所示，热图横向代表不同贮藏时间的茶样，纵向代表化合物，黄色代表化合物相对含量高于平均值，蓝色代表化合物相对含量低于平均值。代表性化合物的含量变化如图3所示。

图2 不同贮藏年份晒青红茶中化合物含量变化热图Fig. 2 Heatmap of compound changes in sun-dried black tea in different storage years

图3 晒青红茶贮藏过程中代表性化合物含量的变化Fig. 3 Changes in contents of representative compounds in sun-dried black tea during storage

2.2.1 贮藏时间对晒青红茶中儿茶素类成分的影响

儿茶素类成分属于黄烷醇类化合物，是茶鲜叶中含量最丰富的多酚类物质，占鲜叶干质量约12%～24%，是茶叶中最重要的多酚类化合物[17]。从图2、3可看出，C、EC、ECG、EGCG、GC含量随着贮藏时间的延长而减少。这些结果与之前研究茶叶中儿茶素的变化规律相符，即儿茶素在茶叶贮藏过程中含量逐渐降低[8,10]。与贮藏初期相比，贮藏4 a晒青红茶中EGCG的下降幅度最大，降幅达到了74.3%；然后依次是GC、C和ECG，下降幅度分别为73.2%、58.1%和56.6%，下降幅度最小的是EC，为28.7%。相关研究表明儿茶素可以聚合形成二聚儿茶素，如TF、原花青素、聚酯型儿茶素等[18]。红茶中儿茶素含量在贮藏过程中减少，这可能是由于儿茶素性质不稳定，在贮藏过程中自身发生了氧化或异构化等反应，形成了新的物质。此外，不同于其他红茶的高温干燥，日光晒干的干燥温度较低，晒青红茶中残留的酶还具有活性，儿茶素可能与残留的多酚氧化酶发生酶促氧化反应，生成TF、茶红素、茶褐素等儿茶素聚合物。

2.2.2 贮藏时间对晒青红茶中二聚儿茶素类成分的影响

TFs是红茶在发酵过程中形成的特征化合物，红茶发酵的实质是鲜叶细胞在揉捻后细胞破损，多酚类化合物与氧化酶接触，引起多酚类化合物的酶促氧化聚合作用，形成TF和茶红素[19-21]。目前为止，已发现鉴定的TF类有12种，其中TF、TF-3-G、TF-3′-G、TF-DG是4种主要的结构[21]。TF对红茶的汤色和滋味有重要的影响，而且具有减肥、降脂等多种保健功效[22-23]。在本研究中，TF、TF-3-G、TF-3′-G、TF-DG含量具有相似的变化趋势，贮藏过程中整体呈明显的下降趋势。其他二聚儿茶素，如原花青素B2、聚酯型儿茶素A和聚酯型儿茶素F含量在贮藏过程中也发生显著变化。原花青素B2含量在贮藏1 a急剧下降，在贮藏3、4 a下降幅度较小。聚酯型儿茶素A在贮藏1、3、4 a呈现阶梯式下降，而聚酯型儿茶素F在贮藏1、3 a逐渐下降，在贮藏4 a无明显变化（图2、3）。 TF是儿茶素类成分氧化聚合过程中的中间产物，随着贮藏时间的延长，其含量降低可能是进一步发生了氧化聚合反应，生成茶红素、茶褐素等儿茶素高聚物。

2.2.3 贮藏时间对晒青红茶中氨基酸类成分的影响

氨基酸是茶叶中的主要化学成分之一，茶叶中游离氨基酸的含量、组成及其转化产物对茶叶的整体品质具有直接影响，一般认为氨基酸含量较高的茶叶具有较好的风味品质[24-25]。茶氨酸是茶叶中独特的氨基酸，在红茶中占总氨基酸含量的50%以上[24]。由图3可知，与贮藏初期相比，茶氨酸含量在贮藏1、3 a显著降低，降幅分别为43.5%、78.4%，在贮藏4 a下降幅度为75.7%。色氨酸含量在贮藏1 a下降幅度为3.7%，贮藏3 a显著下降，降幅为48.6%，贮藏4 a降幅为46.1%。然而缬氨酸含量在贮藏后增加，贮藏1、3、4 a的增加幅度分别为18.1%、34.6%、25.5%。整体而言，晒青红茶贮藏过程中氨基酸含量的变化趋势与本实验室前期在绿茶贮藏过程中发现的氨基酸含量变化规律基本一致[10]。随着贮藏时间的延长，晒青红茶中茶氨酸和色氨酸含量的减少，可能是氨基酸自身的氧化降解或与还原糖发生美拉德反应生成某些色素类物质和香气成分。晒青红茶贮藏过程中缬氨酸含量的增加可能与水溶性蛋白的分解有关。

2.2.4 贮藏时间对晒青红茶中EPSF类成分的影响

茶氨酸可通过一系列Strecker降解和环化反应形成 1-乙基-5-羟基-2吡咯烷酮，该产物进一步在儿茶素的C6或C8位发生取代反应，形成EPSF化合物。EPSF化合物最早是由日本科学家在红茶中分离纯化得到[26-28]。因为取代位点的碳原子为手性原子，所以EPSF化合物具有R型和S型两种构型[29]。本课题组在年份白茶中发现了7种在EC、EGC、ECG、EGCG的C8位取代形成的EPSF类成分（(S)-EC-cThea、(R)-EC-cThea、(S)-EGC-cThea、(R)-ECGcThea、(R)-EGC-cThea、(R)-EGCG-cThea、(S)-EGCGcThea），并且发现这些化合物可用于白茶贮藏时间的判别预测[30-31]。进一步在绿茶中也发现了这7种EPSF化合物，在19个月贮藏过程中这7种EPSF化合物的含量呈线性增加，为绿茶贮藏过程中含量增加最为显著的化合物[10]。 本研究中在晒青红茶中共发现6种EPSF类化合物， (S)-EC-cThea、(R)-EC-cThea、(S)-ECG-cThea、(R)-ECGcThea、(R)-EGC-cThea、(R)-EGCG-cThea表现出相似的变化趋势，在贮藏过程中含量均显著升高（图2），这与之前的研究结果[10,30-31]一致。这6种EPSF化合物含量与晒青红茶贮藏时间呈强正相关，相关系数分别为0.937、0.986、0.892、0.802、0.984和0.900（图4），说明这6种EPSF化合物的含量在贮藏过程中基本呈线性增加。这也解释了儿茶素类、茶氨酸和1-乙基-5-羟基-2-吡咯烷酮在贮藏后含量显著降低的原因。

图4 晒青红茶中EPSF含量与贮藏时间的Pearson相关性Fig. 4 Pearson correlation between EPSF contents and storage period of sun-dried black tea

2.2.5 贮藏时间对晒青红茶中黄酮糖苷类成分的影响

黄酮糖苷是茶叶中重要的黄酮类化合物，作为茶叶中重要的苦涩味成分，其味觉阈值较低且对咖啡碱的苦味有一定的增强作用。黄酮糖苷按照苷元分类，可分为槲皮素苷、山柰酚苷、芹菜素苷和杨梅素苷；按照糖基分类，可分为芸香苷、半乳糖苷、葡萄糖苷、阿拉伯糖苷等[32-33]。如图2、3所示，不同年份晒青红茶的黄酮糖苷含量不同。其中，黄酮-C-糖苷（包括芹菜素-6,8-C-二葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖基-8-C-阿拉伯糖苷、牡荆素等）、山柰苷（山柰酚-3,7-二鼠李糖苷）和山柰酚-3-葡萄糖苷在晒青红茶贮藏后含量明显升高。而大部分黄酮醇-O-糖苷，包括山柰酚-3-芸香苷、山柰酚-3-半乳糖苷、山柰酚-3-阿拉伯糖苷、山柰酚-3-双香豆酰葡萄糖苷、山柰酚-3-(6-乙酰半乳糖苷)、山柰酚-3-(6″没食子酰葡萄糖苷)、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-芸香苷、槲皮素-3-(3-p-香豆酰基葡萄糖苷)和2″-O-反-对香豆酰紫云英苷等在贮藏后含量都有不同程度的减少。这与本课题组前期的研究结果一致，即大部分黄酮醇-O-糖苷在贮藏过程中含量减少[30]，而黄酮-C-糖苷在贮藏过程中含量增加[10]。

2.2.6 贮藏时间对晒青红茶中其他化合物的影响

咖啡碱是茶叶中最主要的嘌呤生物碱和重要的苦味呈味物质，对于红茶品质具有重要作用[7]。红茶中咖啡碱主要以游离态形式存在，结合态咖啡碱约占咖啡碱总含量0.07%，主要是与TF等色素结合形成的复合物[34]。如 图2、3所示，随着贮藏时间的延长，晒青红茶中咖啡碱含量逐渐增加，这与之前对白茶的研究结果[31]一致。与贮藏0 a相比，贮藏1、3 a和4 a的晒青红茶中咖啡碱含量增加幅度均较小，分别为2.8%、7.1%和9.9%。相应地，随着晒青红茶贮藏时间的延长，可可碱含量降低。因此推测在晒青红茶贮藏过程中，可可碱可能发生甲基化反应形成了咖啡碱。此外茶叶贮藏过程中，核糖核苷酸降解生成嘌呤核苷酸，提供嘌呤环，也可能促进咖啡碱含量的增加[17]。

3 结 论

本实验应用基于UPLC-Q-Exactive/MS的代谢组学方法对贮藏0、1、3 a和4 a晒青红茶的化合物变化规律进行分析。结果表明，该方法可以较准确全面地检测晒青红茶中的化合物，经峰面积校准后共得到1 221种化合物离子，最终鉴定出82种化合物离子，包括6种儿茶素类、9种二聚儿茶素类、5种氨基酸类、8种生物碱类、8种酚酸类、3种有机酸类、2种香气糖苷类、6种EPSF类化合物、20种黄酮糖苷类、10种脂类和5种其他化合物。通过PLS-DA模型发现晒青红茶贮藏过程中化合物发生较大变化，并在不同年份晒青红茶样品间筛选出具有显著差异的化合物共66种。对这66种化合物进行热图分析，结果显示，儿茶素（C、EC、ECG、EGCG和GC）、二聚儿茶素（TF、TF-3-G、TF-3′-G、TF-DG、原花青素B2、聚酯型儿茶素A和聚酯型儿茶素F）、氨基酸（茶氨酸和色氨酸）、大部分黄酮醇-O-糖苷（山柰酚-3-芸香苷、山柰酚-3-半乳糖苷、山柰酚-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-芸香苷等）在贮藏后含量降低；咖啡碱、黄酮-C-糖苷和EPSF类化合物（(S)-ECcThea、(R)-EC-cThea、(S)-ECG-cThea、(R)-ECG-cThea、(R)-EGC-cThea、(R)-EGCG-cThea）在贮藏后含量升高。其中6种EPSF化合物含量与贮藏时间的相关系数为0.802～0.986，表明其含量在贮藏过程中基本呈线性增加趋势。本研究采用代谢组学方法较为系统全面地查明了晒青红茶贮藏过程中非挥发性成分的变化规律，可为年份红茶化学物质基础的阐明和科学贮藏提供理论依据。