QuEChERS结合UPLC-Q/Orbitrap HRMS法测定小麦粉中9种真菌毒素

齐春艳，许秀丽，国 伟，李 翔，吴玉平

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.广东省食品检验所（广东省酒类检测中心），广东 广州 510000）

真菌毒素又名霉菌毒素，是真菌在适宜的环境条件下产生的小分子次级代谢产物，广泛存在于谷物、蔬菜和水果等农产品及其制成品中[1]。目前，已发现的真菌毒素高达400余种，其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、AFB2、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）等较为常见。大部分真菌毒素在烹调加热或加工条件下不易被破坏，且具有致癌、致畸、致突变的“三致”作用，以及免疫抑制、生殖紊乱、器官损伤等毒性作用，严重威胁人类及动物的生命健康[2-4]。真菌毒素污染因其普遍性、严重性以及防控难等特点，已成为世界性的公共安全问题[5-6]。

目前真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法[7-8]、 薄层色谱法[9]、毛细管电泳法[10-11]、液相色谱法等[12-14]，这些传统的检测方法具有成本低廉、操作简单等优点，但是也存在灵敏度不高、假阳性率高，且一次只能检测一种或一类真菌毒素等缺点，无法满足痕量水平下真菌毒素的高通量检测的需求。近年来，质谱联用技术，尤其是高效液相色谱-串联质谱技术，在真菌毒素检测方面的优势日益凸显[15-16]。其中，超高效液相色谱-四极杆/静电轨道离子阱高分辨质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap HRMS）结合了四极杆的高选择性和离子阱的高灵敏度、高分辨率的优势，可实现目标物的准确定性。与三重四极杆相比，UPLC-QOrbitrap HRMS无需逐个优化目标物质谱参数，且打破了传统三重四极杆质谱检测化合物数量的限制，可满足真菌毒素的高通量筛查[17]。

目前真菌毒素最常见的前处理方法是采用免疫亲和柱或多功能净化柱等净化柱进行固相萃取[18-19]，这些方法存在过程繁琐、耗时长、成本高等问题，且无法满足样品中多种毒素快速、准确检测的需求。Anastassiades等[20]在基质固相分散的基础上开发了QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safety）快速样品前处理技术，其原理是利用PSA、C18或GCB等吸附剂与基质中的杂质（蛋白、脂肪酸、色素等）相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。该方法具有快速、经济、高效等优点，已广泛应用于农药残留、兽药残留、食品添加剂、真菌毒素等各个检测领域[21-26]。

小麦是我国第二大粮食作物，我国一半以上的居民以小麦为主食，因此小麦及制品在我国食品消费中占据重要地位[27]。2016—2019年国家粮食加工品监督抽检结果显示，小麦粉的主要问题为真菌毒素超标[28]，因此本实验以小麦粉为研究对象，采用UPLC-Q/Orbitrap HRMS技术与QuEChERS前处理方法相结合，建立小麦粉中9种真菌毒素的快速筛查、精准定性和准确定量方法。通过一级全扫描获得目标物的精确质量数，进行定性和定量。同时结合数据依赖性二级扫描模式获得目标物的二级特征质谱图，为准确定性提供双重保障。本研究能够快速、准确、高效地完成小麦粉中真菌毒素的快速筛查和定量测定，旨在为保障我国食品安全提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9种真菌毒素标准品：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、OTA、OTB、OTC标准溶液 美国Romer Labs公司；2种真菌毒素同位素内标品：13C17-AFB1、13C20-OTA标准溶液 美国Romer Labs公司。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（均为色谱纯） 美国Thermo Fisher公司；乙酸铵（LC-MS级） 德国西格玛奥德里奇贸易有限公司；超纯水（实验室一级水）由Milli-Q超纯水机制备。

QuEChERS提取盐包（4 g硫酸镁、1.0 g氯化钠、1.0 g柠檬酸二钠盐水合物、0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水合物） 美国安捷伦科技有限公司；dSPE净化管（150 mg PSA、150 mg C18、900 mg硫酸镁） 美国安捷伦科技有限公司；GHP针式过滤器（0.2 μm） 美国波尔有限公司。

1.2 仪器与设备

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪 美国Dionex公司；Q-Exactive Orbitrap超高分辨质谱仪 美国 Thermo Fisher公司；XP 105DR电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；移液器（1～10 μL、10～100 μL、100～ 1 000 μL、0.5～5.0 mL） 德国Eppendorf公司；Vortex-Genie2多功能旋涡混合器 美国Scientific Industries公司；KQ-500DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限 公司；Allegra X-22R离心机 美国贝克曼库尔特有限 公司；MFV-24智能氮吹仪 得泰仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）；进样量5.0 μL；柱温35 ℃；流动相：A为2 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸），B为甲醇；流速0.30 mL/min；梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.2 质谱条件

离子源：加热电喷雾电离源；扫描模式：正离子模式；采集模式：全扫描/数据依赖性二级扫描；鞘气流量：40 arb；辅助气流量：10 arb；喷雾电压：3.8 kV；离子源温度：350 ℃；毛细管温度：320 ℃。一级扫描范围：m/z100～1 000；一级扫描分辨率70 000；自动增益控制进入轨道阱中的离子数（AGC target）：1×106；最大注入时间（Maximum IT）：100 ms；二级扫描分辨率：17 500；AGC target：1×105； Maximum IT：50 ms；归一化碰撞能量：20、40、60 eV。9种真菌毒素质谱信息见表2。

表2 9种真菌毒素的质谱分析参数Table 2 Mass spectral parameters for nine mycotoxins

1.3.3 小麦粉样品处理

称取均匀试样2.0 g置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，准确加入5.0 mL水，涡旋，样品充分浸润后，加入10 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液，涡旋振荡2 min，超声10 min，加入QuEChERS提取盐包，振摇1 min， 10 000 r/min离心5 min。取8.0 mL上清液转移至含有复合吸附剂的dSPE净化管中，涡旋1 min，10 000 r/min离心5 min。取上清液5.0 mL至氮吹管中，于40 ℃水浴下，氮气吹干。加入内标溶液，用80%甲醇溶液定容至1.0 mL，涡旋振荡1 min，过0.22 μm滤膜，供UPLC-Q-Orbitrap HRMS测定。

1.4 数据处理

分别采用SPSS 22.0软件和Origin 8.0软件进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS对9种真菌毒素混合标准溶液进行正负离子扫描，得到一级全扫描质谱图，发现AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2在负离子模式下无响应，OTA、OTB、OTC在正离子模式下响应值高于负离子模式，最终确定扫描模式为正离子模式。9种真菌毒素的分子离子峰均为[M+H]+，且9种真菌毒素的精确质量相对偏差小于不大于1.91×10-6（表2），符合高分辨质谱检测的要求[29]。同时采用数据依赖性二级扫描，采集目标物的二级质谱图作为进一步的定性依据（表3）。

表3 9种真菌毒素的主要碎片离子Table 3 Major fragment ions of nine mycotoxins

2.2 流动相的选择

本实验考察3种不同的流动相体系，分别为0.1%甲酸溶液-甲醇体系、0.1%甲酸溶液-乙腈体系、2 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-甲醇体系。结果显示，有机相为甲醇时，各真菌毒素的响应高于乙腈体系，因此选择甲醇作为有机相。同时在水相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L 乙酸铵，在一定程度上改善峰形，同时乙酸铵的加入可以抑制[M+Na]+峰，提高[M+H]+峰的响应，从而提高分析灵敏度。因此最终选择2 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-甲醇体系作为流动相。各真菌毒素图谱见图1。

图1 9种真菌毒素和同位素内标的提取离子流色谱图Fig. 1 Extracted ion current chromatograms of nine mycotoxins and isotope internal standards

2.3 提取条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

提取溶剂是决定化合物回收率高低的一个至关重要的因素。为获得尽可能高的回收率和尽可能少的基质干扰，本实验选取甲醇和乙腈作为提取溶剂进行比对，结果发现甲醇虽然比乙腈具有更好的溶解性，但易将小麦粉中的蛋白质、淀粉和脂肪等杂质提取出来，导致提取液中基质干扰较多，不利于后续的盐析和净化，因此选择乙腈作为提取溶剂。

部分毒素具有羧基基团，如OTA、OTB等，降低提取溶剂的pH值能提高含羧基基团毒素的稳定性和回收率。因此本实验对比甲酸体积分数对回收率的影响情况。结果显示，当甲酸体积分数分别为0.1%、0.5%、1%、2%以及5%时，9种真菌毒素的平均回收率分别为80.0%、85.0%、97.8%、102%以及102%。不同种类真菌毒素回收率受提取溶剂中甲酸含量的影响不同，其中6种黄曲霉毒素的回收率受提取溶剂中甲酸体积分数变化的影响较小，3种赭曲霉毒素类的回收率随着提取溶剂中甲酸含量的增大而增加。在甲酸体积分数为0.1%时，OTA和OTB两种毒素基本无回收率。当甲酸体积分数达到5%时，回收率基本稳定，与甲酸体积分数为2.0%无明显差异（P＞0.05）（图2）。因此，选择2.0%甲酸-乙腈作为提取溶剂。

图2 提取溶剂对9种真菌毒素回收率的影响Fig. 2 Effect of extraction solvents on the recoveries of nine mycotoxins

2.3.2 提取溶剂体积的选择

提取溶剂体积同样也对化合物回收率有一定影响。本实验对比提取溶剂体积为5、10 mL以及15 mL时，各目标化合物的回收率情况。结果显示，当提取溶剂体积5、10 mL以及15 mL时，9种真菌毒素的平均回收率为92.6%、100%以及99.7%。大部分真菌毒素回收率随着提取溶剂体积的增加而增大。OTB、OTC随着提取溶剂体积的增加回收率先增加后减小，这可能由于提取溶剂体积增加，提取到的杂质也随之增加，使得回收率有所降低（图3）。因此，综合回收率、浓缩时间两方面因素，最终选择提取溶剂体积为10 mL。

图3 提取溶剂体积对9种真菌毒素回收率的影响Fig. 3 Effect of extraction solvent volume on the recoveries of nine mycotoxins

2.3.3 复溶溶剂的选择

复溶溶剂是指用来溶解样品浓缩后所得残渣的溶液。选取不同的复溶溶剂溶解样品残渣对目标化合物回收率有一定的影响，特别是极性较小的真菌毒素，需要较高比例有机相才能溶解，但有机相比例含量过高，可能会出现较大的溶剂效应。因此实验比较50%乙腈溶液、50%甲醇溶液、80%乙腈溶液以及80%甲醇溶液作为复溶溶剂对回收率的影响（图4）。结果显示，复溶溶剂为50%乙腈溶液、50%甲醇溶液、80%乙腈溶液以及80%甲醇溶液时，9种真菌毒素的平均回收率分别为97.2%、92.0%、100%以及99.3%。其次，根据选用的流动相类型，最终选取80%甲醇溶液作为复溶溶剂。

图4 复溶溶剂对9种真菌毒素回收率的影响Fig. 4 Effect of re-dissolving solvents on the recoveries of nine mycotoxins

2.4 线性范围、检测限、定量限测定结果

以9种真菌毒素标准品的峰面积为纵坐标，相应质量浓度（μg/L）为横坐标，进行线性回归计算，得到线性方程和相关系数。确定该方法的线性范围、线性方程、检出限、定量限见表4。结果表明，9种真菌毒素在0.25～100 μg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数（R2）大于0.99。检出限范围为0.10～1.00 μg/kg，定量限范围为0.30～3.00 μg/kg，低于GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中规定的指标[30]。

表4 9种真菌毒素的线性范围、检出限和定量限Table 4 Linear ranges, LODs and LOQs of nine mycotoxins

2.5 回收率和精密度实验结果

根据各真菌毒素在小麦粉基质中的定量限，设计低、中、高3个水平的加标实验，计算加标回收率和相对标准偏差。如表5所示，9种真菌毒素的加标回收率为70.2%～112.0%，相对标准偏差为0.2%～4.5%，说明本实验方法满足实验要求。

表5 9种真菌毒素的加标回收率和相对标准偏差（n=3）Table 5 Spiked recoveries and precision RSD of nine mycotoxins (n = 3)

2.6 实际样品测定结果

采用本研究建立的方法对从超市购买的19 份小麦粉进行检测，采用一级精密质量数和保留时间对样品中的9种真菌毒素进行定性筛查，并结合二级特征碎片离子确证。其中一份面粉样品检出AFB1，含量为 0.89 μg/kg，参考GB 2761—2017限量标准规定的小麦粉AFB1的限量为5.0 μg/kg，未超过限量值[30]。该结果与GB 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》[31]检测结论一致。

3 结 论

本实验将UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术与QuEChERS前处理方法的优势相结合，用于小麦粉中9种真菌毒素的快速筛查、精准定性和准确定量研究。超高分辨质谱仪通过一级全扫描获得目标物的精确质量数，在一定程度上消除基质干扰，提高定性和定量准确性。同时以数据依赖性二级扫描模式获得目标物的二级特征质谱图和保留时间等为基础，构建了真菌毒素类物质数据库，该数据库作为自建质谱数据库可以不断扩充，从而实现小麦粉中真菌毒素的快速筛查和精准确证。本研究能够快速、准确、高效地完成小麦粉中真菌毒素的快速筛查和定量测定，为保障我国食品安全提供技术支持。