基于UPLC-Q/Orbitrap HRMS多目标快速筛查鱼肉中30种蛋白同化激素及糖皮质激素

郭添荣，吴文林,,*，张 崟，万渝平，叶 梅，陈代伟，黄 霞，张龙翼

（1.成都市食品检验研究院，四川 成都 611130；2.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041；3.中国科学院大学，北京 100049；4.成都大学 肉类加工四川省重点实验室，四川 成都 610106）

激素是由生物体分泌且具有调节或影响机体生长代谢的微量活性物质，主要包括蛋白同化激素、糖皮质激素等[1]。蛋白同化激素具有蛋白质同化作用，可以有效促进骨骼发育壮大，缩短动物生长周期[2-3]。糖皮质激素具有调节动物机体的脂肪、糖类合成和代谢作用，促进动物生长繁殖，因此存在以提高经济利益为目的在鱼类养殖中违规使用的现象[4-6]。研究表明，长期食用蛋白同化及糖皮质激素含量超标的食品，可能引起肾上腺功能亢进、肥胖以及骨质疏松等疾病[7-10]。我国农业部第235号公告和GB 31650—2019《食品中兽药最大残留限量》中对激素药物限量具有明确规定[11]，欧盟与美国相关组织也早已颁布了相关禁限令[12-13]。为满足监管需要，建立一种多目标快速筛查激素残留的方法显得十分必要。

目前蛋白同化激素及糖皮质激素残留检测方法主要有免疫分析法[14]、高效液相色谱法[15]、液相色谱-串联质谱法[16-18]、液相色谱-四极杆飞行时间质谱法[19-20]等。其中免疫分析法检测周期较长且受活性酶种类限制而逐渐被取代，高效液相色谱法仅能分离几种特定的物质且难以区分相同或相近物质而应用受限，液相色谱-串联质谱法虽为主流检测方法，但受到分析模式和分辨率限制，难以实现对复杂样品的高通量多目标分析，液相色谱-四极杆飞行时间质谱法具有灵敏度高、适用范围广等优势，但因串级功能不全以及面对同分异构体物质分辨率不够而定性能力受到限制[21]。超高效液相色谱-四极杆/静 电场轨道阱高分辨质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high-resolution mass spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap HRMS）法将高选择性的四极杆与超高分辨率、高灵敏度的静电场轨道阱有机结合，针对复杂样品基质的多种激素检测，在建立激素数据可追溯性电子身份数据库的基础上，实现在无标准品对照情况下对化合物进行大批量多目标快速筛查[22-23]，目前已被广泛应用于组学研究、环境检验以及违禁药物检查等[24-27]众多领域，研究报道多应用于肉类食品与保健品中多肽类、大环内酯类以及糖皮质类[28-29]的筛查，本实验将该技术用于鱼肉中30种蛋白同化及糖皮质激素的多目标快速筛查研究，以期为鱼类中激素残留风险监测提供有效的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇（均为色谱级） 美国Thermo Scientific公司；甲酸、乙酸铵（均为色谱级） 美国Sigma Aldrich公司；Oasis®HLB、Oasis®PRiME HLB固相萃取柱（6 mL 200 mg） 美国Waters公司；Captiva EMR Lipid固相萃取柱（6 mL 600 mg）、陶瓷均质子（100个/瓶） 美国Agilent公司；超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美国Millipore公司；10种蛋白同化激素标准品（去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、甲睾酮、诺龙、丙酸睾酮、群勃龙、美雄酮、苯丙酸诺龙、美睾酮） 美国Cato Research Chemicals Inc公司；20种糖皮质激素标准品（丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、曲安奈德、曲安西龙、可的松、地塞米松、醋酸氢化可的松、倍氯米松、氟米松、布地奈德、醋酸氟轻松、醋酸氟氢可的松、氟米龙、丙酸氯倍他索、醛固酮、泼尼松，纯度均不小于95.0%） 中国食品药品检定研究院；36 批次鱼（多宝鱼、鳜鱼、乌鱼和草鱼各9 批次） 市购。

1.2 仪器与设备

Vanquish Horizen-Q Exactive Plus高分辨质谱系统 美国Thermo Fisher公司；ORTEX3旋涡混匀器、 T18 basic均质机 德国IKA公司；3K15高速冷冻离心机 美国Sigma Aldrich公司；Turbovap LV浓缩氮吹仪 美国Biotage Caliper Zymark公司；Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司；ME203型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取2.00 g（精确至0.01 g）匀浆试样，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入80%乙腈溶液（含0.2%甲酸）10 mL，静置10 min后再加入两粒陶瓷均质子，快速剧烈振摇并旋涡振荡30 min（2 000 r/min）使样品充分散开，9 500 r/min高速离心5 min，取上清液待净化。取5 mL准确量取的上清液过6 mL 200 mg的Oasis PRiME HLB固相萃取柱，流速为1 滴/s，收集4 mL后半段流出液并准确量取2 mL，氮气下吹至近干，初始流动相定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，同时做试剂空白实验一同上机测试。

1.3.2 仪器条件

UPLC条件：Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；色谱柱温度25 ℃；流速0.5 mL/min；流动相A（水相）为含0.1%甲酸的乙酸铵（20 mmol/L） 溶液，流动相B（有机相）为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，95% A、5% B；0.5～15 min，2% A、98% B；15～20 min，2% A、98% B；20～20.1 min，95% A、5% B；20.1～25 min，95% A、5% B。进样量10 μL。

HRMS条件：加热电喷雾离子源；扫描采集方式：正负离子同时采集，一级全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/dd-MS2）（Top N）；喷雾电压3.5 kV（+），-3.0 kV（-）；离子传输管及加热器温度325 ℃和450 ℃；鞘气及辅助气（N2）流速：35 arb和10 arb；质量扫描范围m/z100～1 000；分辨率75 000（Full MS）、17 500（dd-MS2）；C-Trap中离子数最大容量：3×106（Full MS）、2×105（dd-MS2）；C-Trap中最大注入时间：100 ms（Full MS）和50 ms（dd-MS2）。

1.3.3 数据库的建立

本研究基于Xcalibur 4.1中TraceFinder 4.1和mzVault软件搭建数据库。首先收集30种激素化合物的中英文名称、分子式、CAS号等基本信息，并在Full MS全扫描模式下获取30种化合物的准确保留时间、母离子精确质量数等信息（表1），随即导入数据库中，得到可用于高通量快速筛查的指纹识别数据库。在dd-MS2模式下，经不同碰撞能量下发生裂解得到的高能量碰撞解离（high energy collision dissociation，HCD）碎片离子质谱图汇总形成用于进一步谱图匹配确证的谱图库。

1.3.4 基质效应的计算

将30种激素标准品分别通过4种鱼肉基质以及甲醇制备为标准溶液，通过甲醇纯溶剂和基质溶液中同一物质的标准曲线斜率之比，对化合物的基质效应状况进行评价。基质效应按下式计算：

评价依据：80%≤基质效应≤120%，表示基质效应不明显，可忽略不计；基质效应＜80%或基质效应＞120%，表示基质抑制或增强，说明存在基质效应。

1.4 数据处理

在TraceFinder 4.1分析软件中，运用建立好的指纹识别数据库对UPLC-Q/Orbitrap采集的样品数据进行检索匹配分析，利用质谱软件的自动去卷积功能，并与指纹识别数据库中的保留时间、精确母离子质量数、碎片离子质量数等相关参数进行对比（可疑化合物判定：保留时间偏差介于±0.5 min，离子质量数偏差介于±5×10-6）， 针对可疑化合物利用HCD碎片离子谱图库进一步确证，使用基质匹配标准曲线外标法进行定量分析。借助OriginPro 2019b和WPS Office 2019搭配制图。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂及体积的选择

文献[30-31]报道，常用提取剂有乙酸乙酯、乙腈、乙腈溶液且添加适量甲酸可有效增加提取效率，本实验以多宝鱼、鳜鱼、乌鱼和草鱼为基质，以试样加标测定值与试样浓度之差除以加标量计算单个基质的平均加标回收率，考察乙酸乙酯、乙腈、体积分数80%与90%的乙腈溶液、含0.2%与1.0%甲酸的80%乙腈溶液6种提取剂下30种激素的提取效果，结果见图1A。乙酸乙酯和纯乙腈作为提取溶剂，4种鱼肉的加标回收率处于较低水平，可能是两者共提物较多且易结块；乙腈溶液提取效率明显高于乙酸乙酯和纯乙腈，可能是乙睛溶液具有蛋白沉淀作用，其中体积分数80%的乙腈溶液提取效率高于体积分数90%，可能是高体积分数乙腈下目标化合物被大量变性蛋白质包裹而不易被解离提取；体积分数80%乙腈溶液中加入0.2%甲酸提取效率高于1.0%甲酸，可能是高体积分数甲酸降低了样品溶解性，影响了离子化效率。故选择0.2%甲酸-80%乙腈溶液为提取溶剂。

图1 提取溶剂种类（A）及最适提取溶剂体积（B） 对30种激素回收率的影响Fig. 1 Effects of different extraction solvents (A) and different volumes of 80% acetonitrile aqueous solution containing 0.2% formic acid (B) on recoveries of 30 hormones

在此基础上，实验分别考察80%乙腈-0.2%甲酸溶液体积为5、10、15 mL对30种待测激素提取效果的影响，见 图1B。使用10 mL提取溶剂的平均回收率均明显高于5 mL，而10 mL与15 mL提取溶剂的平均回收率无显著差异，可能是在10 mL提取溶剂下目标化合物已基本实现提取完全。考虑成本与环保节能，最终选择10 mL作为提取剂体积。

2.1.2 固相萃取柱及填料量的选择

鱼肉基质复杂，样品经提取后仍需净化。实验分别考察C18、Oasis HLB、Oasis PRiME HLB和Captiva EMR Lipid四种萃取柱对4 类鱼肉中激素分离净化效果，结果见图2A。采用C18时，4 类鱼肉中30种激素平均回收率最低，可能是由于传统C18吸附剂难以同时兼顾所有激素性质，Oasis PRIME HLB的净化效果均明显优于Oasis HLB和Captiva EMR Lipid，表明Oasis PRIME HLB能够更好地对样品中的磷脂和蛋白质等杂质进行吸附。另有研究表明[32]，PRIME HLB是多兽残专用且适配高分辨质谱，该萃取柱无需活化与平衡且效果显著，适合大规模样品的快速净化处理。

图2 萃取柱（A）及填料量（B）对30种激素回收率的影响Fig. 2 Effects of different extraction columns (A) and packing amounts (B) on recoveries of 30 hormones

同时，实验考察Oasis PRIME HLB不同填料用量（1 mL 30 mg、3 mL 60 mg、3 mL 150 mg、6 mL 200 mg、6 mL 500 mg）对目标物的吸附净化效果。见图2B。当填料由1 mL 30 mg增加到3 mL 150 mg时，4 类鱼肉的萃取效率迅速提高；当填料高于3 mL 150 mg时效率增速放缓；当填料量为6 mL 200 mg和6 mL 500 mg时，两者对多宝鱼中激素的吸附净化效果相当，但前者对其他3 类鱼肉基质的吸附效果均最好。故最佳填料量为 6 mL 200 mg。

2.2 UPLC条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

要同时实现对30种性质不同激素的有效分离，需要选取兼容性、柱效较好且耐用的色谱柱。实验考察Thermo Accucore aQ C18（2.1 mm× 00 mm，2.6 μm）、Agilent Eclipse plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）以及Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）3种色谱柱对30种化合物的分离效果。结果表明，部分激素在Thermo Accucore aQ C18和Agilent Eclipse plus C18色谱柱上均存在不同程度的峰形拖尾和峰形尖锐度较差的现象。而Waters Acquity BEH C18色谱柱能够较好保留30种激素化合物，峰形无明显拖尾且尖锐对称。可能是由于该色谱柱独特的键合与极性基团端基封尾技术，确保了其兼顾不同极性化合物的保留性能更佳。故本实验色谱柱选择Waters Acquity BEH C18（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）。

2.2.2 流动相体系及流速的选择

流动相体系直接影响分析物的保留时间和峰形，由于30种激素均易溶于乙腈，因此本实验分别选取乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-20 mmol/L乙酸铵、乙腈-20 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）共4种流动相组合进行分析。结果显示：乙腈-水作为流动相时，各组分的峰形较差且正离子响应较低；乙腈-5 mmol/L乙酸铵所获取的色谱峰形明显优于乙腈-水，但部分蛋白同化激素存在峰形较差。当乙酸铵浓度加大至20 mmol/L时，峰形均得到明显改善，继续向乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液中添加0.1%甲酸，此时各待测物峰形均达到最佳，表明适量甲酸的加入有助于改善峰形。故本实验流动相体系为乙腈-20 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）溶液。在此基础上考察0.3、0.4 mL/min和0.5 mL/min三种流速下待测物的分离效果。结果表明，在3种流速下，30种目标化合物均能有效分离，而当流速为0.5 mL/min时，不仅色谱峰形尖锐，还能够最大限度地缩短保留时间，故流动相流 速为0.5 mL/min。

2.3 HRMS条件的优化

30种激素化合物在加热电喷雾离子源下产生多种准分子碎片离子峰，实验采用全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/dd-MS2）模式，对30种激素混合标准溶液进行正负离子同时扫描，得到一级全扫描质谱图，以各化合物的准分子碎片离子峰理论精确质量数提取色谱图，此条件下30种化合物的精确质量相对偏差均小于1.0×10-6，满足实验需求。同时，实验还在多种分辨率值考察中发现，当一级全扫描质量分辨率为75 000，数据依赖二级扫描质量分辨率为17 500时，30种激素待测物与样品基质中的干扰物均实现基线分离，响应值也得到明显提高，表明在此分辨率条件下样品中的基质干扰得到有效消减。图3为30种激素的提取离子色谱图。

图3 30种激素化合物的提取离子色谱图Fig. 3 Extracted ion chromatograms of 30 hormone compounds

2.4 基质效应评价

鱼肉基质复杂，可能存在基质抑制或基质增强效应，故进行基质效应评价。如表2所示，在多宝鱼中， 30种激素的基质效应均在80%～120%范围内，即基质效应不明显；在鳜鱼中，表睾酮、倍氯米松、泼尼松表现为基质抑制效应；在乌鱼中，美雄酮、可的松表现为基质抑制效应，氢化可的松表现为基质增强效应；在草鱼中，表睾酮、美雄酮、氟米松、氟米龙、泼尼松表现为基质抑制效应。为获得更加准确的检测结果，本实验在定量环节通过基质匹配标准曲线消除或减弱基质效应的影响。

表2 30种激素的线性关系、基质效应、LOD和LOQTable 2 Linear relationships, matrix effects, limits of detection and limits of quantification of 30 hormones

续表2

2.5 方法的线性关系、基质效应、LOD和LOQ

将鱼肉空白提取液配制30种化合物的标准工作液，在已优化的分析条件下进行测定。以目标化合物色谱峰面积（Y）及其对应组分质量浓度（X）绘制标准曲线，并计算获得待测物质的线性回归方程及其相关系数（r），分别以3 倍信噪比和10 倍信噪比计算出方法的LOD和LOQ。由表2可知，鱼肉中30种激素在0.5～100 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.995 0。方法的LOD和LOQ依次为0.2～1.0 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg，均满足实验需求。

2.6 回收率和精密度结果

向多宝鱼、鳜鱼、乌鱼、草鱼的空白样品中分别添加30种激素的标准溶液配制成阳性样品，按照已建立的方法，在1、5 倍和10 倍LOQ三个添加水平下各重复测定6 次，求解得到回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。添加水平在1～10 倍LOQ时，30种激素在多宝鱼基质中的回收率为72.1%～103.2%，RSD为2.6%～9.4%；在鳜鱼基质中的回收率为69.7%～101.1%，RSD为2.3%～8.9%；在乌鱼基质中的回收率为69.9%～99.3%，RSD为3.2%～9.2%；在草鱼基质中的回收率为69.9%～103.2%，RSD为2.8%～9.1%。表明本研究建立的方法准确度和精密度均满足实验需求。

表3 30种激素在鱼肉中的回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 30 hormones spiked in fish (n = 6)%

2.7 实际样品筛查

应用本研究建立的方法对36 批次市售鱼肉样品（多宝鱼、鳜鱼、乌鱼和草鱼各9 批次）进行检测，样品经前处理和上机测试后，利用TraceFinder软件中已建数据库对样品中30种激素进行多目标定性筛查，可疑样品结合HCD二级特征碎片离子确证，使用基质匹配标准曲线外标法定量。1 批次样品草鱼中检出氢化可的松 （3.9 μg/kg），其余样品均未检出30种激素药物。各项指标均达到筛检要求，表明结果准确可靠。

3 结 论

本实验以4种鱼肉作为研究对象，建立多目标快速筛查和确证鱼肉中30种蛋白同化激素及糖皮质激素的分析方法，样品经80%乙腈-0.2%甲酸溶液提取后离心，上清液经Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化后过滤膜上机测试。30种激素的添加回收率为69.7%～103.2%，RSD为2.3%～9.4%；LOD为0.2～1.0 μg/kg，LOQ为0.5～2.0 μg/kg。 该方法优势明显，更加快捷高效、准确可靠，能满足日常鱼肉样品中30种蛋白同化激素及糖皮质激素快速筛查的需要。