烙灸对大鼠腰椎间盘突出髓核重吸收过程中腰肌损伤修复的VEGF 的影响*

马兰洁 杨忠明 许建峰， 童 昕 林瑞珠， 田 良 孙博文 尤 娜 李国豪

（1.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学总医院中医骨伤科，宁夏 银川 750004；3.宁夏医科大学总医院康复科，宁夏 银川 750004；4.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004）

烙灸疗法是中医化脓灸的发展与深化，它是用烙药（用燃烧或具有刺激性的药物）或铁器烧灼（加热了的特制医用器具）直接烙烫于病痛体表部位，使局部发红或发泡（灸时须使皮破），促使机体康复的一种治疗方法，是中医药学的重要组成部分。

我们前期实验发现：烙灸疗法具有明显的促进突出的髓核重吸收的作用，同时在实验过程中发现，被剔除背部毛发的大鼠通过烙灸后肌肉恢复状态及毛发增长速度都较未烙灸的大鼠快。而在中医基础理论中指出“血为发之余”，毛发的旺盛有赖于血液的充盈；“脾在体合肉，脾主统血”说明血液可以营养滋润肌肉。因此均可说明血在肌肉恢复与毛发生长中具有重要的作用。由此我们提出烙灸疗法可能对大鼠的血液生成具有促进作用。

通过查阅文献发现，血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前最强的血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管新生的作用[1，2]。因此，我们提出烙灸疗法可能提高脊髓中VEGF 的表达，从而促使大鼠肌肉的恢复、新血管的生成及毛发的生长的假说。因此，本研究旨在阐明烙灸疗法对血管内皮生长因子的调节机制，进一步探讨烙灸对新生血管的生成具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选择健康Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，雄性，体质量300 g，宁夏医科大学动物中心提供，动物饲养在宁夏医科大学实验动物中心进行。动物合格证号：SCXK（宁）2011-0001。标准条件下饲养，每日自由摄取纯水和标准饲料饲养。实验前喂养5 d 以适应环境，经观察无异常后，按体质量由轻到重进行编号（1～30号），然后采用SPSS 17.0 统计软件包将大鼠随机分成3组：烙灸组、模型对照组和空白对照组各10 只。除空白对照组10 只大鼠以外，其余20 只大鼠采用椎间盘椎硬模外埋置法造模。

1.1.2 实验试剂 磷酸盐缓冲液（PBS）：上海源培生物科技股份有限公司；VEGF、GAPDH：Abcam；RI PA裂解液、磷酸酶抑制剂：碧云天；BCA蛋白定量试剂盒：碧云天；脱脂奶粉：生工生物；1.0M Tris-HCl（pH 6.8）、1.5M Tris-HCl（pH8.8）：雷根生物；PMSF、5 × Loading Buffer、Glycine、SDS、Tris Base、Sodiumchloride、过硫酸铵、TEMED、30%Acr-Bis：少辛生物；NC 膜：Pall；ECL 发光液：圣尔生物；艾绒购于宁夏医药公司[豫郑食药监械（准）字2012 第1270003 号]。

1.1.3 实验设备 移液器（Eppendorf），台式高速离心机（Eppendorf 公司、Centrifuge 5804R），小型高速离心机（Eppendorf 公司、Centrifuge 5424），掌上离心机（SCI LOGEX赛洛捷克、S1010E），通用电泳仪电源（韦克斯科技有限公司、WIX-EP600），电泳仪（天能公司、EPS 600），半干转移电泳槽（天能公司、Tanon VE-386），全自动化学发光图像分析系统（天能公司、Tanon-4600），脱色摇床（Kylin-Bell 公司、TS-1000），涡旋振荡器（Scientific Industries、G560E），酶标仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司、1510），超纯水机（上海睿析科学仪器有限公司、NPTK-3.2G），灭菌锅（ZEALWAY公司、GI 54DS）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模

1.2.1.1 尾椎切除 采用公认尾椎椎间盘腰椎硬膜外埋置的造模方法，烙灸组和模型对照组20 只SD大鼠，20% 乌拉坦（1 mL/100 g）经腹腔行注射麻醉，麻醉成功后，剃除尾部体毛，用橡皮筋扎住大鼠尾部，并进行常规消毒。无菌条件下，每只大鼠均切取包括2 个完整间盘长度的尾椎，需包含上下软骨终板。用针刺破上下终板，使髓核暴露，造成游离状态或破裂状态。用7 号手术线进行“米”字形包绕，切取尾椎后放入生理盐水器皿中备用。

1.2.1.2 腰椎造模 大鼠腰椎的皮肤剃毛后常规消毒，无菌条件下沿后正中线后路切开背部皮肤、皮下组织及腰背筋膜，沿棘突剥离骶棘肌，用缝合线分开肌肉组织暴露腰椎，去掉L2～5椎板，露出腰椎硬膜。将取出的尾椎间盘小心放置在腰椎硬膜外，并取可吸收的明胶海绵贴在移植髓核表面，逐层缝合。烙灸组和模型对照组的大鼠从造模1 个月后进行干预，6 个月后进行取材。

1.2.2 治疗方法 （1）烙灸组：10 只大鼠从造模1 个月后进行干预。固定在固定器上，沿大鼠腰椎纵轴方向进行剃毛，将特制的2 cm× 0.5 cm× 0.5 cm长方体铁制灸具以腰椎纵轴方向放置，覆盖L1～L6椎体表面，将铁制灸具的中心放置在大鼠L3～L4间隙，然后将灸槽内2 g艾绒点燃，经燃烧的艾绒可以使铁制灸具发热，并将热量向下传导使局部皮肤出现潮红，1 次/d，每次10 min。干预6 个月后进行取材。（2）模型对照组：10 只大鼠造模1 个月后在固定器上固定10 min，每天1 次，不予其他干预，6 个月后进行取材。（3）空白对照组：10只大鼠不予造模和干预，6 个月后处死并进行取材。

1.2.3 取材 实验大鼠采用空气栓塞法处死，取出埋置在腰椎硬膜外的尾椎椎间盘并剔除周围软组织，先行大体观察并记录，后用0.9%氯化钠注射液冲洗，将尾椎间盘液氮冻存，然后置于-80 ℃ 冷冻冰箱中用于Western-Blot 检测。

1.2.4 Western Blot 检测VEGF 蛋白相对表达量 取冻存的髓核组织，通过研磨及离心处理后进行蛋白定量测定，通过电泳、转膜、免疫杂交、化学发光、显影、定影和凝胶图像分析等步骤，检测VEGF 蛋白的表达情况。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行大鼠分组和数据分析，采用ONE-ANOVY对Western Blot 法检测的结果进行方差分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 Western Blot 的检测结果

采用Western Blot 法检测实验各组尾椎间盘髓核中VEGF 的表达情况，空白对照组表达量较少，模型对照组为0.5，烙灸组为0.8，模型对照组与烙灸组的髓核细胞中VEGF 的表达量明显高于空白对照组（P ＜0.05），而烙灸组的髓核细胞中VEGF 的表达量也高于模型对照组（P ＜0.05）。以上数据提示，烙灸疗法可以促进大鼠椎间盘髓核细胞中VEGF 的表达，促进新生血管的生成。见图1、图2。

图2 髓核细胞中VEGF 的蛋白相对表达量

3 讨论

烙灸疗法是民族医药学之中的一朵奇葩，是中医药学的重要组成部分。它是用烙药（用燃烧或具有刺激性的药物）或铁器烧灼（加热了的特制医用器具）直接烙烫于病痛体表部位，使局部发红或发泡（灸时须使皮破），促使机体康复的一种治疗方法。烙灸疗法在于排出异常体液及代谢禀性衰败过程中的四液病理产物，促进四性、四液平衡，达到人体所需要的体液平衡，同时可以温阳补肾、温经散寒、活血消肿、强筋壮骨、利水消肿[3]。古代医家发现艾叶苦燥辛散，易于走窜，方便热力穿透肌肤从而温通经络、祛风散寒、除湿止痛；《本草纲目》中记载艾叶能“温中，逐冷，除湿”；《名医别录》谓其能“主灸百病”。因此，烙灸利用艾绒、铁具加热所产生的火热刺激，活血行气，激发人体内的潜能，通过皮肤和血管感受器的反射传入中枢神经系统，来调节气血运行，其能够扩张血管，调节循环[4]，不仅可以提高机体自然抗病能力，而且能够更有效地促进新血管的生成及肌肉的恢复，使全身经脉通畅，也有利于相应器官组织功能的恢复[5]。

血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEPF）又叫血管通透因子，是血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）家族的一个成员，广泛分布于正常组织如脾、垂体、肾脏、肾上腺、卵巢、骨骼肌中。VEGF 也是目前最强有力的血管生成因子，其可以促进血管内皮细胞的分裂和增殖，增加血管的通透性，还可聚集细胞质中的钙离子[6]。组织细胞中分泌VEGF 是机体生理及病理性组织生长和损伤修复的基础。在正常生理状态下VEGF 表达呈低水平；但当骨骼肌损伤后，缺氧和缺血能够诱导组织细胞释放VEGF[7]。实验证实肌肉损伤后的早期VEGF 及VEGF-mRNA表达明显增高，与损伤早期的血管化程度密切相关[8]。将表达了的重组肌肉细胞与肌肉组织同时移植，可显著增加再生血管的数量和肌肉的体积[9]。

VEGF 还能够直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分裂，并能够增加微血管的通透性，促进内皮细胞表达纤溶酶原、纤溶酶原激活抑制物、间质胶原酶及凝血酶原，使血聚纤维蛋白外渗，导致纤维素在损伤组织、肿瘤间质或其他生理病理组织间沉积，促进巨噬细胞、成纤维细胞及内皮细胞生长，从而生成新血管[10]。因此，VEGF 在损伤后血管再生的过程中扮演着重要的、不可缺少的角色[7]。

烙灸疗法是一种强刺激疗法，它结合中医理论及针灸经络特点，利用药物、器械加热所产生的火热刺激，通调气血，直接或间接地激发体内的潜能，通过皮肤和血管感受器的反射途径传到中枢神经系统，调节兴奋和抑制过程。其通过扩张血管，调节循环，增强局部耐受性及机体抵抗力[11]。而通过对大鼠的造模，造成其脊髓不同程度的损伤，以至于大鼠气血不调，经络堵塞造成肢体活动不利。治疗则需要较强的刺激方法，才能增强其周围神经刺激量，以激发VEGF 的表达。

根据实验结果我们发现烙灸组的VEGF 的表达量明显高于模型对照组及空白对照组，说明烙灸可以增加VEGF的表达，促进其发挥再生血管的作用，在血管的生成、成熟及毛细血管网、微循环的重建中发挥重要的作用。烙灸疗法是中医化脓灸的发展与深化，具有刺激面积大、施灸量可控及铁制灸具传递热量迅速、均匀等优点，具有浓郁的民族特色，且对皮肤的损伤程度较轻，对元气的振奋与恢复更加迅速[12]。该特色疗法拥有悠久的历史，在长期的传承和应用中，积累了丰富的临床经验，治疗效果可靠，对医疗设备设施的依赖小，技术操作便于掌握，适宜临床推广，也节约大量的医疗费用和卫生资源[3]。