一种SARS-CoV-2 快速检测方法的建立与应用*

鲁 静，孙 静，张顺皓，刘慧敏，宣世海，王旭东**

(1 南通大学附属医院检验科，南通 226001；2 江苏省东台市人民医院检验科；3 江苏省南通市第三人民医院检验科)

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情自2019 年底爆发以来[1]，在国内外对社会生活各方面造成了很大的影响。我国采取“动态清零”政策并结合疫苗接种在控制疫情方面取得了很大的成功。由于病毒的突变，出现了高传播能力的德尔塔、奥密克戎等突变株[2]，造成国内部分地区疫情的反复。为快速扼住疫情的发展，对病毒快速检测的需求越来越大。目前，用于诊断新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARSCoV-2)感染的方法有很多，如检测病毒抗原的免疫学方法[3]、检测病毒核酸的分子生物学方法[3-5]。但抗原的检测受检测灵敏度限制，主要用于个人自检或一些特殊的现场筛查。卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》明确提出病毒核酸是COVID-19 的临床确诊标准。WHO 也推荐COVID-19 感染诊断的金标准是逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)[6]。常规的荧光PCR 检测技术检测全过程时间超过3 h[7]，远不能满足医院急诊、高速路口等时效性要求高的场所。

SARS-CoV-2 是一种正链RNA 病毒，基因组长29 903 bp[3,8]，其中有14 个开放阅读框(open reading frame,ORF)编码27 种蛋白质。目前常用的检测靶点包括ORF1ab 基因、核衣壳(N)基因、刺突蛋白(S)基因和包膜蛋白(E)基因[8]。本研究开发了一种一步法快速检测技术，分别设计两对针对病毒保守序列ORF1ab 基因和N 基因的引物和荧光探针，另外设计一对针对人细胞内参基因(如Rnase P)的引物和探针用于监控核酸提取过程和采样的质量。通过优化反应条件，整个检测过程在1 h 内完成。

1 材料和方法

1.1 材料及来源 实验阴性样本39 例来自南通大学附属医院的普通筛查标本，临床验证的阳性样本25 例来自南通市第三人民医院(阳性标本检测在三院核酸实验室完成)。实验用试剂高性能Taq 酶及2× PCR 反应液购自北京TAKARA 公司，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水购自Biosharp公司，引物由上海睿勉公司合成。实时荧光定量PCR 仪采用16 孔小型化学专用扩增仪，购自南通EGENS生物技术有限公司(YS-qRCR-1 型)。

1.2 检测方法与结果判读

1.2.1 引物探针序列的设计 使用引物设计软件Snapgene V4.0，导入SARS-CoV-2 的全部基因组，分别设计ORF1ab 基因、N 基因和内参基因的上下引物及探针片段，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 核酸提取方法 按照厂家说明书的步骤快速提取核酸(硕世生物科技股份有限公司)，其采用具有分离作用的磁珠和缓冲系统，与核酸提取仪配合使用，从样品中分离纯化得到高质量的核酸。

1.2.3 PCR 反应体系 Buffer 12.5 μL，Taq 酶1 μL，DEPC 水4 μL，Rd 引物混合物0.625 μL(终浓度625 nmol/L)，Rd 探针0.3 μL(终浓度150 nmol/L)，N引物混合物0.625 μL(终浓度625 nmol/L)，N 探针0.25 μL(终浓度125 nmol/L)，IC 引物混合物0.5 μL(终浓度500 nmol/L)，IC 探针0.2 μL(终浓度100 nmol/L)，待测样本RNA 模板5 μL，共25 μL。

1.2.4 PCR 扩增条件 逆转录50 ℃恒温3 min；94 ℃预变性30 s；94 ℃2 s，58 ℃12 s 循环40 次，在循环步骤58 ℃时读取荧光值。

1.2.5 结果判读 在仪器正常、阳性对照和空白对照均正常的情况下进行结果分析：FAM 通道为SARSCoV-2 的ORF1ab 基因、VIC 通道为N 基因，当待测样本单通道或双通道检测结果Ct≤38，曲线呈S 型且有明显指数增长期判定为阳性；当所有通道Ct＞38或未检出时判定为阴性。CY5 通道为内标，Ct 应≤37，否则采样复测。

1.3 验证方法和指标

1.3.1 阴、阳性符合率 选取64 例鼻咽拭子标本，采用已经上市且经过性能验证的A 和B 两种厂家试剂盒检测样本，分别与本研究候选方法比较阴、阳性符合率和总体符合率。

1.3.2 精密度评价 批间精密度是使用1 份精密度校准品检测4 次/d，连续检测5 d，共测定20 次。批内精密度是用1 份精密度校准品连续检测10 次/d。根据检测结果，分别计算样本Ct 值的标准差(stan dard deviation,SD)及变异系数(coefficient of variation,CV)，如CV<5%，则精密度符合要求。

1.3.3 最低检出限 使用定值为1 000 copies/mL的室间质评样本与无核糖核酸酶水按倍比混合，配置浓度为500、250、125、62.5、31.25 copies/mL的样本重复检测3 次(图1)。由于62.5 copies/mL 和31.25 copies/mL 的样本重复检测10 次未能满足95%以上的检出率，故最低检出限视为125 copies/mL(图2)。

图1 线性评估

图2 最低检出限

1.3.4 稳定性验证 将配好的试剂放入-20 ℃冰箱，避免反复冻融，2 个月后取出重新检测125 copies/mL的样本3 次。

1.3.5 干扰物质 用试剂检测分别有甲型流感病毒(H1N1)、EB 病毒、轮状病毒的混合液观察ORF 基因和N 基因有无交叉反应。将1 份弱阳性样本分别混入奥司他韦、青霉素、地塞米松等药物，与加入无核糖核酸酶水作为对照。提取后重复检测3 次，实验组与对照组Ct 值的绝对偏差≤1.6 为符合要求。

1.4 统计学方法 应用Excel 2019 对数据进行整理；在SPSS 26.0 软件采用χ2检验分析阴、阳性符合率和总体符合率，P<0.05 为差异有统计学意义；利用GraphPad Prism7.0 软件制作折线图分析最低检出限。

2 结果

2.1 阴、阳性符合率 选取64 例鼻咽拭子标本分别用A 厂家、B 厂家和候选方法进行符合率比较，A 厂家的阳性样本均有明显扩增曲线，且Ct 值≤37；B厂家的阳性样本均有明显扩增曲线，且Ct 值≤38。由表2 可见，与A 厂家相比，候选方法阳性符合率为100.0%，阴性符合率为61.5%，总符合率为76.5%；与B 厂家相比，候选方法阳性符合率为92.5%，阴性符合率为87.5%，总符合率为90.6%；3 组数据之间差异有统计学意义(χ2=9.458,P=0.009)。

表2 A、B 厂家方法符合率验证比较

2.2 精密度 ORF1ab 基因和N 基因批间精密度的Ct 值分别为32.98±0.62 和32.58±0.60，CV 值分别为1.9%、1.8%，均<5%，结果符合要求；批内精密度的Ct 值分别为32.92±0.06 和32.54±0.08，CV 值均为0.2%<5%，结果符合要求。

2.3 最低检出限 重复检测浓度为125 copies/mL的样本20 次，ORF1ab 基因和N 基因均有明显扩增曲线且Ct 值<38，阳性检出率为100%。此外还检测国家灵敏度参考品，S1、S2、S3、S5 为阳性，S4 为阴性，均符合要求。

2.4 稳定性 125 copies/mL 样本的3 次检测结果，ORF1ab 基因和N 基因均有明显扩增曲线且Ct 平均值<38，表明试剂在-20 ℃冰箱放置2 个月仍可保持稳定。

2.5 抗干扰能力 对H1N1、EB 病毒、轮状病毒均无交叉反应，奥司他韦、青霉素、地塞米松等药物不会对SARS-CoV-2 核酸结果产生明显干扰。

3 讨论

常规的荧光PCR 检测技术耗时较长，需要昂贵的仪器设备、复杂的样本预处理以及专业的技术人员。对医院急诊、高速路口等时效性要求高的场所，有必要发展快速准确的核酸检测技术。因此本研究针对SARS-CoV-2 开发了一种特异、灵敏且快速的检测方法，全部检测在1 h 内完成。该方法主要通过3 个方面缩短检测时间：(1)通过核酸释放剂直接裂解细胞释放病毒核酸，省略核酸提取环节；(2)设计较短的扩增子并采用高性能的Taq 酶，优化扩增反应条件等方法来缩短反应时间，普通的Taq 酶催化效率150 bp/s，高性能Taq 酶催化效率更快；(3)采用16孔小型化的专用扩增仪，提高仪器反应速度。

候选方法与另两个厂家的阳性符合率均>90%。与两种厂家的符合率存在差异，可能是设计的SARS-CoV-2 引物序列不同导致与靶序列结合的差异，提示一方面可以通过增加简并引物的方式提高检出率，另一方面有必要用第二厂家的试剂验证阳性结果，特别是一些所谓“翘尾”的现象。

综上所述，本研究成功建立了一种新型的SARS-CoV-2 核酸快速检测方法，对SARS-CoV-2的ORF1ab 基因、N 基因检测并结合人类RNase P作为内参基因，利用实际的阳性样本进行比较分析，建立的快速检测方法与已有市售的试剂盒对比，灵敏度更高。非常适合当前疫情防控下快速检测SARS-CoV-2 的要求，有较好的应用前景。