微管蛋白乙酰化修饰与生物学功能

沈 宓，程正慧，季煜华，丁 斐

(南通大学 教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通 226001)

微管是存在于中心粒、纤毛、鞭毛、神经元轴突和纺锤体纤维中的细胞骨架成分。在大多数细胞中，微管参与细胞内运输、细胞分裂、形态变化和运动。微管是由13 根原丝组成的中空圆柱形结构，微管蛋白是具有极性的细胞骨架成分，其中包含在同一方向垂直聚合的α-微管蛋白(α-Tubulin)和β-微管蛋白(β-Tubulin)异二聚体。微管并不单独发挥作用，与影响其动力学和组装的各种微管相关蛋白(microtubule associated protein,MAP)之间相互作用。一些MAP 蛋白特异性地与微管蛋白结合，调节微管的稳定性、动态变化和动力学，包括与其他细胞结构之间相互的作用。微管在线粒体和囊泡等细胞器和物质的输送，以及神经递质的释放中发挥重要作用。微管运输过程中需两类马达蛋白：驱动蛋白质和马达蛋白质。微管在细胞质的乙酰化修饰发生在α-Tubulin的赖氨酸第40 位(Lys-40,K40)上，该乙酰化位点暴露在微管腔中。

1 微管蛋白的乙酰化修饰

微管蛋白的乙酰化修饰通常是指α-Tubulin K40被乙酰化修饰。在四膜虫中导入α-Tubulin K40R 突变体，发现野生型α-Tubulin K40，而非突变体α-Tubulin K40R 会被α-Tubulin 乙酰转移酶1(α-Tubulin acetyltransferase 1,αTAT1)乙酰化，提示K40 可能是αTAT1 唯一的乙酰化修饰位点。该乙酰化修饰位点从原生动物到哺乳动物都是保守的。K40 的乙酰化修饰也是目前在α-Tubulin 管腔中发现的唯一的翻译后修饰位点，用来催化K40 乙酰化修饰的酶需进入狭窄的微管内腔中，α-Tubulin 在K40 处的可逆乙酰化修饰是独特的，因为它发生在微管的腔表面，但对它如何进入管腔的目前还不清楚。

β-Tubulin 的乙酰化修饰发生在赖氨酸第252位(K252)上，但此修饰只存在于可溶性α-Tubulin 与β-Tubulin 异二聚体中，影响微管蛋白的聚合动力学。这种乙酰化修饰由乙酰基转移酶SAN 催化而来，并可抑制微管中的Tubulin 掺入。siRNA 干扰HeLa 细胞中SAN 基因的表达可使微管再生加速。提示β-Tubulin K252 的乙酰化修饰可能通过降低微管的组装速度来调控微管动力学。

迄今为止，K40 是已知的唯一发生的在聚合微管上的乙酰化修饰位点，所以这种修饰被普遍称为微管的乙酰化修饰。然而，通过蛋白质组学研究人急性髓系白血病细胞系MV-4-11 时发现，α-Tubulin和β-Tubulin 上还存在着多个其他的乙酰化修饰位点[1]，对这些新位点的存在和功能还有待证实。

2 微管蛋白的乙酰化调节

微管蛋白的乙酰化修饰水平主要受到两种酶调节：αTAT1 和组蛋白脱乙酰基酶6 (histone deacety lase 6,HDAC6)。αTAT1 是体内高度保守的特异性乙酰化修饰α-Tubulin K40 的乙酰基转移酶。研究最初从衣藻的提取物中检测到了乙酰基转移酶的活性，在遗传筛查触觉敏感性缺陷的秀丽隐杆线虫中发现了MEC-17。在2010 年，MEC-17 与哺乳动物同源基因αTAT1 均被鉴定为α-Tubulin 乙酰化酶，两者均具备α-Tubulin 的乙酰基转移酶的活性。与MEC-17 相比，αTAT1 基因的缺失导致了小鼠的胚胎与各种组织中的α-Tubulin 蛋白乙酰化几乎完全丧失[2-3]。因此，哺乳动物体内主要的微管蛋白乙酰化酶被认为是αTAT1。

HDAC6 是目前普遍认为的微管蛋白的主要去乙酰化酶。2002 年首次发现了HDAC6 是一种与微管共定位的α-Tubulin 去乙酰化酶，HDAC6 仅定位于细胞质中，与微管结合并定位于含有p150 的微管马达蛋白复合物，通过HDAC6 对Trichostatin A 与Trapoxin 两种药物反应的差异，发现α-Tubulin 为主要的乙酰化修饰蛋白，且为HDAC6 的底物。通过失活小鼠胚胎干细胞中的Hdac6 基因可导致α-Tubulin 过度乙酰化修饰，从而影响微管网络的稳定性[4]。此外，β-Tubulin 被鉴定为与HDAC6 特异性相互作用的蛋白质，通过与β-Tubulin 结合，HDAC6 可被募集到微管蛋白二聚体或微管中，且可使α-Tubulin的K40 去乙酰化[5]。

3 微管蛋白乙酰化修饰在细胞功能和疾病中的作用

3.1 在微管稳定性中的作用 α-Tubulin 的乙酰化修饰与微管的稳定性相关，但目前无法证明α-Tubulin 乙酰化修饰是微管稳定的结果还是标志，α-Tubulin 乙酰化修饰如何调节微管的稳定性仍存在争议。

微管的稳定性取决于HDAC6 的表达或活力的下降，而不是微管蛋白乙酰化修饰水平本身，HDAC6 的抑制剂Tubacin 可增加微管的乙酰化修饰，抑制HDAC6 去乙酰化活性会降低微管生长和收缩的速率，HDAC6 的药理抑制和基因沉默可增加α-Tubulin 的乙酰化修饰，但采用siRNA 干扰引起的HDAC6 基因的敲降不影响微管的生长速度[6]。

MEC-17 的丢失引起的α-Tubulin 蛋白乙酰化导致线虫轴突中微管的不稳定。通过敲除鼠中的MEC-17 会导致α-Tubulin 蛋白的乙酰化丧失，使微管解聚增加，微管侵入生长锥和丝足中，神经元易于轴突过度分支和过度生长。在MEC-17 缺陷的神经元轴突中，微管蛋白是高度动态的，其突变频率和生长速度增加，寿命缩短。外源性导入具有乙酰转移酶活性的MEC-17 可促进微管蛋白的稳定，这可能是因为MEC-17 在正常存在的情况下，α-Tubulin 蛋白乙酰化后，细丝之间的横向相互作用减弱，软化了微管，加快了微管收缩的速度，增强了微管的机械弹性和灵活性，使微管能更好地抵抗机械应力。通过转染无乙酰转移酶活性的MEC-17 后，发现无法拯救微管的高度动态，说明微管的稳定性与MEC-17 的乙酰转移酶活性有关。但微管的稳定可通过表达模拟乙酰化的α-Tubulin 突变体来恢复[7]。

3.2 调节细胞迁移和极性 微管细胞骨架的动力学也在神经元迁移中起着至关重要的作用。α-Tubulin 蛋白乙酰化水平的降低可能引起神经元迁移的障碍，这可能与一些皮质疾病有关。在沉默Srpx2 获得的癫痫大鼠模型中，由于Srpx2 的缺失引起α-Tubulin 蛋白乙酰化水平的降低，错位的Srpx2 沉默神经元会出现顶端树突的非径向取向，且在Srpx2沉默的皮质神经元中，树突长度、分支和数量减少。而大脑皮质部分神经元仍可保持多极状态但无法径向迁移，说明Srpx2 沉默会损害神经元迁移和定向。此外，微管蛋白去乙酰化酶抑制剂Tubacin 的母体给药可防止子宫内Srpx2 沉默引起的异常神经元迁移表型和产后神经元癫痫样活动[8]。

在类风湿性关节炎个体的T 细胞中，微管蛋白乙酰化稳定了微管细胞骨架并将线粒体定位在核周位置，导致细胞极化、尾足形成、T 细胞迁移和组织侵袭[9]。

微管蛋白乙酰化对于调节细胞的极性也很重要。表达突变型亨廷顿病蛋白的神经元的运输缺陷可被HDAC6 抑制剂逆转。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的磷酸化缺陷型突变体(T475A)减少了背根神经节与海马神经元微管蛋白乙酰化水平，改变了细胞形态，并降低了神经元的极性。使用HDAC6 的抑制剂逆转了这种作用[10]，表明HDAC6 可通过微管蛋白去乙酰化调节神经元极性。

在肿瘤细胞中发现一些转移性较强细胞株的α-Tubulin 蛋白高度乙酰化，并伴有从核周辐射的乙酰化微管的聚集或密度增加，而非转移性细胞系中α-Tubulin 蛋白乙酰化的水平较低。通过选择性抑制HDAC6 微管蛋白乙酰化修饰对于癌细胞的黏附和迁移至关重要。α-Tubulin 乙酰化修饰在转移性乳腺癌细胞中显著增加。此外，α-Tubulin 乙酰化修饰增强细胞突起并促进细胞重新附着，增加细胞迁移和侵袭[11-12]。相反，肺癌细胞中α-Tubulin 乙酰化的增加会增加细胞黏附面积并抑制细胞迁移、侵袭和肿瘤转移[13]。转化生长因子-β 激活激酶1[transforming growth factor(TGF)-β-activated kinase 1,TAK1]被TGF-β 刺激磷酸化，可通过αTAT1 激活诱导微管蛋白乙酰化，随后激活成釉细胞瘤细胞的迁移和侵袭[14]。虽然目前对α-Tubulin 的乙酰化修饰如何影响癌细胞的迁移和侵袭仍不明了，但α-Tubulin 的乙酰化修饰对癌细胞的黏附和迁移至关重要。

在成纤维细胞中，αTAT1 耗竭会损害接触抑制和多个非极化细胞层的形成[15]。微管蛋白乙酰化修饰水平的改变可调节细胞运动，但微管稳定性不影响运动。α-Tubulin 乙酰化修饰促进皮质投射神经元的迁移和分支，并增加黏着斑和星形胶质细胞迁移。不同细胞类型中微管蛋白乙酰化修饰导致的细胞功能差异可能是由细胞环境和先天特性(包括趋化性)引起的。因此，微管蛋白乙酰化修饰可能通过改变细胞极化、黏附和运动来影响肿瘤转移。

3.3 对神经元轴突运输功能的影响 神经元轴突的正常转运功能是维持神经功能所必须的，囊泡和细胞器的轴突运输对神经元的功能分化以及它们之间连接的建立至关重要。适当的乙酰化修饰有助于微管动力蛋白在微管的轨道上进行物质运输，是正确的轴突运输所需的翻译后修饰。细胞周期依赖性激酶抑制剂p27Kip1 在体外控制着囊泡和细胞器沿着小鼠皮质投射神经元轴突的运输，抑制果蝇中的p27Kip1 直系同源物Dacapo 也会破坏体内轴突运输，其作用都是通过稳定αTAT1 对α-Tubulin 进行适当乙酰化修饰[16]。在Dacapo 缺失的成年果蝇和果蝇的幼虫中增加α-Tubulin 的乙酰化水平，可挽救轴突运输功能的缺陷[16]。

轴突微管的乙酰化修饰水平与神经元的生长、发育及再生相关。通过对线虫的正向遗传筛选发现，α-Tubulin 乙酰转移酶基因MEC-17 会导致轴突变性。在小鼠坐骨神经模型中发现，轴突损伤可诱导周围神经元中微管蛋白的去乙酰化[17]。但有研究[18]显示MEC-17 的乙酰转移酶的活性不是轴突功能的维持所必须的，过表达模拟非乙酰化作用的α-Tubulin K40R 可恢复MEC-17 缺失引起的轴突退化和线粒体在神经元轴突中的分布异常。

3.4 自噬过程中的微管蛋白乙酰化修饰 自噬是一种特定的分子和细胞器的降解过程，分子或细胞器首先被包裹在自噬体中，然后沿着乙酰化的微管传递到溶酶体。饥饿诱导时，微管蛋白乙酰化修饰可参与调节前自噬体结构的形成，并影响基于微管蛋白的自噬体运动。微管蛋白乙酰化修饰决定了自噬体的空间定位和自噬流。微管蛋白乙酰化修饰对于自噬溶酶体的形成也是必不可少的。HDAC6 参与并调节了自噬，HDAC6 通过微管去乙酰化来抑制自噬体的形成和降解。在宫颈癌细胞中，抑制HDAC6 可通过增加微管相关蛋白1 轻链3 (microtubule-asso ciated proteins 1 light chain 3,LC3)乙酰化和减少自噬流来促进微管蛋白乙酰化修饰，并削弱血清饥饿诱导的自噬[19]。自噬体相关肌动蛋白可通过HDAC6依赖性机制聚合以刺激与溶酶体融合[20]。HDAC6 抑制剂通过抑制胶质母细胞瘤细胞中的自噬溶酶体融合，诱导自噬空泡的积聚并消除自噬流[21]。在一些癌症环境中，HDAC6 可控制自噬流。在脊髓损伤后使用HDAC6 抑制剂促进微管的乙酰化和稳定，可能有助于恢复自噬流和增加轴突长度，从而促进脊髓损伤后的功能恢复[22]。HDAC6 介导的α-Tubulin 乙酰化是心肌细胞中酸性pH 依赖性自噬的重要机制，酸性处理后心肌细胞中HDAC6 活性增加，通过Tubastatin A 或特异性siRNA 抑制HDAC6 活性，可上调α-Tubulin 乙酰化和自噬体形成[23]。

调节α-Tubulin 的乙酰化/去乙酰化平衡对自噬具有重要意义。微管蛋白去乙酰化酶SIRT2 也与几种癌细胞系的自噬调节有关。在结肠癌中，SIRT2 下调增强了基础自噬[24]。在人类神经母细胞瘤细胞中过表达SIRT2 时抑制了自噬流[25]。与HDAC6 相比，SIRT2 对癌症自噬影响的了解较少。另外，在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的模型中发现乙酰化是微管依赖性自噬的主要决定因素，抑制SIRT2 可改善阿尔茨海默病中的微管蛋白网络和自噬流，提示自噬中SIRT2 功能与微管蛋白乙酰化修饰调节之间的联系。在稳定表达EGFP-LC3 融合蛋白的H1299 肺癌细胞系中，采用siRNA 干扰αTAT1的表达后，EGFP-LC3 显着增加，表明αTAT1 可能调节自噬过程。另一项研究[26]显示，αTAT1 的下调促进了微管蛋白去乙酰化并消除了对葡萄糖饥饿反应的自噬流。

总之，这些数据都提示了微管蛋白乙酰化的作用以及去乙酰化酶和乙酰化酶在控制自噬过程中的作用。尽管如此，微管蛋白翻译后修饰在驱动自噬体形成和运输中的作用仍存在争议，微管蛋白乙酰化修饰与自噬调节以及疾病之间的联系仍需进一步研究。

3.5 参与免疫和对病毒的反应 微管蛋白的乙酰化参与了免疫应答的过程，对先天性和获得性免疫都很重要。HDAC6 主要在细胞质中调节多种蛋白质的乙酰化，包括α-Tubulin 和热休克蛋白90。Hdac6基因敲除小鼠表现出中度受损的免疫反应。Hdac6基因的缺失或去乙酰化酶活性的抑制增强了炎症和自身免疫中的调节性T 细胞功能，表明HDAC6 抑制有利于治疗结肠炎和抑制同种异体移植排斥[27]。巨噬细胞是介导先天性免疫反应的主要效应细胞。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和IFN-C 在体外激活小鼠RAW264.7 巨噬细胞，可通过增强微管乙酰化修饰和基质金属蛋白酶9 的分泌，从而促进巨噬细胞迁移穿过内皮下基底膜和主要由胶原组成的间质基质，到达靶组织并引发炎症反应。αTAT1 的微管蛋白乙酰化修饰是炎症小体激活所必须的。当受到LPS 的攻击时，RAW264.7 巨噬细胞表现出广泛的微管蛋白乙酰化并诱导产生IL-10。减少αTAT1 的表达抑制了LPS 诱导的微管蛋白乙酰化修饰，并抑制IL-10 产生。而在Hdac6 缺陷型巨噬细胞和小鼠中，LPS 可诱导IL-10 的过度产生，LPS 诱导的p38 激酶激活需要微管蛋白乙酰化[28]，但仍不清楚为什么p38激酶激活需要这种修饰。LPS 仅在人的肺大血管内皮细胞中抑制微管蛋白乙酰化修饰[29]，表明LPS 对微管蛋白乙酰化修饰的影响是细胞类型特异性的。

T 细胞受到刺激后，活化T 细胞的核因子(nuclear factor of activated T cells,NF-AT)被去磷酸化钙调神经磷酸酶，促进与importinb 的相互作用和核转位。α-Tubulin 与NF-AT 的N 末端区域结合并刺激与importinb 形成复合物以进行核转位，而α-Tub-ulin的乙酰化会抑制这个核转位[30]。因此，微管蛋白乙酰化修饰对先天性和获得性免疫都很重要。

此外，乙酰化修饰在对病毒的反应中也很重要。人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染会稳定微管，并刺激宿主细胞中的微管蛋白乙酰化修饰，HDAC6 蛋白过表达可抑制HIV 感染。与HIV 类似，甲型流感病毒会诱导微管蛋白的乙酰化修饰[31]；感染卡波西肉瘤相关疱疹病毒仅30 min，可显著增强微管蛋白乙酰化修饰[32]；感染单纯疱疹病毒1 型约4 h，可增加微管蛋白乙酰化修饰，进而增强热休克蛋白90 与微管的结合并促进病毒衣壳蛋白的核定位[33]。值得注意的是，这种效应与NF-AT 核定位的效应完全相反，表明微管蛋白乙酰化修饰可调节核输入。

3.6 在一些疾病中的作用 病理学上，微管蛋白乙酰化修饰与多种神经系统疾病有关。Charcot-Marie-Tooth 是周围神经系统最常见的遗传性疾病。热休克蛋白27 基因的突变会导致轴索腓骨肌萎缩症或远端遗传性运动神经病。HDAC6 抑制剂可逆转表达热休克蛋白27 的小鼠表现出轴突运输缺陷、轴突丢失和微管蛋白乙酰化修饰降低[34]。

Joubert 综合征是一种影响小脑功能的遗传病，其特征是小脑发育不全、共济失调、精神运动迟缓和新生儿期呼吸模式改变。研究[35]显示疾病中驱动蛋白7 基因的相关突变，并发现该驱动蛋白参与了调节微管蛋白乙酰化修饰和稳定性。帕金森病是一种中枢神经系统的常见神经退行性疾病，富含亮氨酸重复激酶2 (leucine-rich repeat serine/threonine-pro tein kinase 2,LRRK2)基因的突变是该病最常见的遗传原因。在亚细胞水平上，基于微管的轴突运输缺陷是可能的发病原因之一。LRRK2 直接与α-Tubulin 相互作用并抑制β-Tubulin 乙酰化修饰，表明在正常细胞环境中，这种激酶充当负向的微管乙酰化修饰调节剂。肌萎缩侧索硬化症涉及大脑运动皮层的运动神经元变性，表达超氧化物歧化酶1 的G93A 点突变体的转基因小鼠是这种破坏性疾病的已知模型，Hdac6 的缺失显著延长了这种小鼠的生存期并维持了运动轴突的完整性[36-37]。

此外，HDAC6 与衰老相关的疾病如阿尔茨海默病有关。HDAC6 表达减少可改善该疾病小鼠模型中的认知缺陷。抑制HDAC6 活性可改善记忆并降低微管相关蛋白Tau 的水平[38]。由于HDAC6 是体内主要的微管蛋白去乙酰化酶，因此微管蛋白乙酰化修饰在这些过程中可能很重要。然而，这也可能是由于其他HDAC6 功能，如泛素结合能力。在蛋白病理性心力衰竭的模型小鼠中药物抑制HDAC6 的活性可减少毒性蛋白的聚集，增加自噬，改善心功能。在收缩功能障碍的房颤动物模型中，Tubastatin A 的体内治疗可保护心跳加快诱发的心肌细胞的收缩功能障碍和细胞Ca2+处理/收缩的功能障碍的影响[39]。

综上所述，微管乙酰化修饰参与了多种生物学过程、细胞功能和疾病的发生过程。微管蛋白乙酰化与微管蛋白稳定性之间的关系虽然尚不完全清楚，但这种修饰是稳定微管的标志。微管蛋白乙酰化修饰在调节免疫、压力、炎症和病毒反应方面也有一定的作用，近期有研究[40]发现肌球蛋白IF 通过调节α-Tubulin 和微管的乙酰化在促进抗真菌免疫中的关键作用，去乙酰化酶抑制剂SIRT2 可能被开发为治疗真菌感染的潜在药物。

除了微管蛋白乙酰化外，还有其他微管修饰，包括磷酸化、去酪氨酸化、谷氨酰化、甘氨酰化和棕榈酰化等。微管的不同修饰可能会将微管彼此区分开来，并与不同的MAP 结合。因此，对微管蛋白乙酰化修饰对细胞生物学过程的影响、与其他微管修饰的关系、不同的微管蛋白亚型和各种MAP 之间的联系都值得进一步研究。通过对微管的乙酰化修饰的生物学功能的研究可为进一步了解各种生物学功能的发生机制及疾病的治疗提供基础和思路。