碳源等因素对湿地松优良无性系胚性愈伤组织增殖的影响

高启阳 黄宇龙 郭文冰 赵奋成 刘 阳

（广东省林业科学研究院广东省森林培育与保护利用重点实验室，广州 510520）

培养基的pH 会影响培养基中外源激素和营养元素的作用效果，可能对培养物的生长状况产生不同的影响。同时，培养基的pH 还会随着培养过程而发生改变。培养基中碳源的种类及浓度对胚性愈伤组织的增殖和体胚的发育起着至关重要的作用，不仅为胚性愈伤组织的增殖提供能量，还维持着一定的渗透压。不同的碳源种类和浓度会影响胚性愈伤组织的生长，因此选择合适碳源种类和浓度对胚性愈伤组织的增殖尤为重要。谷氨酰胺是针叶树体胚培养中最常见的有机氮源之一，有研究表明大多数松杉等植物在胚性愈伤组织和体细胞胚胎的培养过程中，需要额外添加谷氨酰胺。但由于谷氨酰胺不耐高温，且常温条件下在水溶液中极易分解为氨和焦谷氨酸，使相关培养基的配制和保存难度增加。丙谷二肽是丙氨酸和谷氨酰胺通过缩合反应形成的二肽化合物，以肽键连接，具有在水溶液中稳定、耐高温等特性。在人源细胞培养中，已经开始使用丙谷二肽替代谷氨酰胺，但还鲜见丙谷二肽在松树体细胞胚胎发生研究中的应用报道。

本研究以湿地松优良无性系的胚性愈伤组织为研究材料，探究了不同pH、碳源和谷氨酰胺及其替代物丙谷二肽对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响，期望能够获得适合湿地松胚性愈伤组织增殖的主碳源种类及使用浓度，明确最优pH 范围，并回答谷氨酰胺能否被丙谷二肽替代的问题，以进一步降低培养成本，促进胚性愈伤组织迅速增殖并减轻褐化，为进一步提高湿地松胚性愈伤组织增殖的质量和数量奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2019 年6～7 月从广东台山红岭种子园的湿地松精选种子园（混合代）中，采收优良单株自由授粉的未成熟球果，诱导获得胚性愈伤组织。单种子来源的胚性愈伤组织独立建立胚性无性系，从中选择已继代6 次，增殖能力强，活力好的无性系PEE3-13进行本实验。

1.2 试验方法

1.2.1 胚性愈伤组织的鉴定

从诱导的愈伤组织中选取直径2～5 mm 大小的愈伤组织材料置于载玻片上，用2%醋酸洋红和0.5%伊文思蓝先后对其进行染色，在体视显微镜下观察被染色的细胞团特征。鉴定出的胚性愈伤组织用于增殖培养。

1.2.2 胚性愈伤组织的增殖培养

随着经济发展以及外来文化的影响，复杂、耗时的传统工艺被现代化的快速艺替代，社会流动带来民族文化认同上的缺失，传统土家族服装实用功能减弱。在传统式微的情形之下，土家族服饰逐渐消失在民众生活的视野中。再者，随着新时代对民族文化的消费，土家族服饰在“再设计”的过程中为了迎合表演或者观者“猎奇”的心态发生了很多的变化，现代舞台表演用的土家族服饰除了“西兰卡普”元素之外，已经和苗族、侗族甚至西式礼服相差不大。伴随着土家族传统服饰的“消逝”，现在在民众生活中硕果仅存的就是绣花鞋垫，而且绣花鞋垫伴随着时代发展，其形式、图案都发生了很大的变化。

将愈伤组织置于Y0 固体培养基表面进行继代增殖，暗培养，23±1℃，每隔14 d 继代1 次，继代时优选愈伤块表面新生的细胞团进行继代，以维持无性系的活力。Y0 培养基以mP6 为基本培养基，附加1 g·L肌醇，0.5 g·L水解酪蛋白，0.45 g·L谷氨酰胺，30 g·L蔗糖，1.1 mg·L2，4-D，0.45 mg·L6-BA，0.43 mg·LKT，1.3 mg·LABA和0.96 mg·LBr，以3 g·L植物凝胶（Phytagel）为凝固剂，0.25 g·LMES为pH稳定剂。

1.2.3 培养基pH对胚性愈伤组织增殖的影响

在Y0 固体培养基成分不变的情况下，高压灭菌前用1 mol·L的HCl 和NaOH 准确调节培养基的pH 分别为4.0，5.0，6.0，7.0和8.0，然后进行高压蒸汽灭菌。灭菌后依次加入ABA，Br和谷氨酰胺，充分混匀，取约30 mL 混匀的培养基，待其温凉但未凝固时，用pH 计测定以上设定的几种pH 是否发生变化，记录培养基此时的pH，其余培养基正常倒平板备用。

将PEE3-13 的新生胚性愈伤称量每个平板约0.7 g，轻轻置于培养基表面，并均匀分成7块，每块约0.1 g，记录每个平板的初始接入质量，每个所设定pH 条件下均接入10 板作为10 个生物学重复。将平板置于23±1 ℃，黑暗条件下进行培养，培养14 d 后，准确称重此时平板上的胚性愈伤总质量并记录。

1.2.4 培养基碳源对胚性愈伤组织增殖的影响

以生工生物公司购买的蔗糖、麦芽糖及市场购买的精制白砂糖、红块糖为所测试的碳源种类，设置6个处理：30 g·L蔗糖，20 g·L蔗糖，30 g·L红块糖，45 g·L麦芽糖，20 g·L蔗糖+10 g·L麦芽糖或30 g·L白砂糖。除碳源外，其余培养基成分均与Y0培养基相同，配制方法类似。

PEE3-13 的胚性愈伤组织的继代和称重方法同“1.2.2胚性愈伤组织增殖的最适pH 筛选”，培养条件一致。

1.2.5 谷氨酰胺及丙谷二肽对胚性愈伤组织增殖的影响

以Sigma 公司购买的L-谷氨酰胺和广州乐试生物科技有限公司购买的L-丙-谷二肽为所测试的有机氮源，设置4 个处理：①不添加任何谷氨酰胺或丙谷二肽，②450 mg·L的谷氨酰胺，③670 mg·L丙谷二肽，④870 mg·L丙谷二肽。除谷氨酰胺外，其余培养基成分均与Y0 培养基相同，配制方法类似。

PEE3-13 的胚性愈伤组织的继代和称重方法同“1.2.2 胚性愈伤组织增殖的最适pH筛选”，培养条件一致。

1.3 数据统计分析

增殖率（%）=（每板培养14 d后的质量-每板初始接入的质量）∕每板初始接入的质量×100% （1）

数据统计分析采用SPSS Stasitics 21.0 软件进行，使用Turkey 法进行多重比较并用标记字母法表示差异显著性（不同小写字母代表在＜0.05 水平差异显著）。

2 结果与分析

2.1 湿地松愈伤组织的鉴定

利用湿地松未成熟球果诱导获得的愈伤组织有两种类型：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。胚性愈伤组织染色后在体视镜下可见分生组织细胞团组成的胚头（EC，embryonal mass cells）和胚柄（SC，suspensor cells）结构，而非胚性愈伤中无法观察到这一结构。

对所获得的无性系PEE3-13 的愈伤组织进行染色鉴定，体视显微镜观察发现其具有胚头及胚柄结构，胚头细胞团密集，胚柄细胞呈长条形，紧随在胚头细胞团后（见图1）。因此，所鉴定的愈伤组织由胚性细胞组成，为胚性愈伤组织。

图1 湿地松无性系PEE3-13胚性愈伤组织的细胞形态观察EC.胚头；SC.胚柄Fig.1 Cell morphology observation for embryogenic callus of the clone PEE3-13EC.Embryonal mass cells；SC.Suspensor cells

2.2 不同pH对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响

对增殖培养基灭菌前和灭菌后的pH 分别进行了测定，结果表明，灭菌前培养基调整至某一确定的pH 后，在灭菌后仍会发生较大变化。当灭菌前的pH 小于6.0 时，灭菌后的pH 升高，灭菌前pH越低，升高越多；当灭菌前的pH 大于或等于6.0时，灭菌后的pH 降低，灭菌前pH 越高，降低越多（见表1）。因此，灭菌前调整培养基的pH 至固定值并不能代表培养时该培养基的实际pH。

在不同pH 条件下，胚性愈伤的培养后质量和增殖率有很大差别（见表1）。当灭菌前pH 调整为6.0，灭菌后pH 变为5.68 时，胚性愈伤的培养后质量和平均增殖率最高，平均增殖率可达到436.20%，但与灭菌前调整pH 为7.0 时没有显著差异，说明培养基实际pH 范围为5.68～6.28 时，均适宜胚性愈伤组织的生长。当灭菌前pH 调整为4.0，灭菌后pH 变为4.77 时，胚性愈伤的培养后质量和平均增殖率最低，此时培养基凝固困难，呈凝胶流动状。当灭菌后pH 未落在最适范围内时，平均增殖率均有所下降，说明胚性愈伤组织在增殖过程中对pH 仍较为敏感。综上，在培养基灭菌前将pH 调节至6.0～7.0 左右，能够保证灭菌后pH 在最适范围内，最大限度降低pH 对胚性愈伤组织增殖的影响。

表1 不同pH对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响Table 1 Effects of different pH on the embryogenic callus proliferation in P.elliottii

2.3 不同碳源对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响

利用市售的精制白砂糖、红块糖与试剂公司购买的蔗糖和麦芽糖进行胚性愈伤组织增殖的比较研究，结果表明，不同碳源对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响非常显著（见表2）。增殖培养后质量及增殖率均在使用30 g·L白砂糖作为碳源时达到最高，平均增殖率可达到851.27%，胚性愈伤组织团呈白色，表面有丝状突起，生长状态好（见图2f）；而在使用45 g·L的麦芽糖作为碳源时平均增殖率最低，仅为29.51%，胚性愈伤组织团大多萎缩不生长（见图2d）；当蔗糖与麦芽糖结合使用时，平均增殖率虽高于仅使用蔗糖的处理，但差异不显著（见表2）；市售红块糖可能因其杂质成分较多，培养后质量及平均增殖率均不理想，且胚性愈伤组织发黄变褐（见图2c）。

图2 不同碳源成分及浓度条件下湿地松胚性愈伤组织的生长情况a.30 g·L-1蔗糖；b.20 g·L-1蔗糖；c.30 g·L-1红块糖；d.45 g·L-1麦芽糖；e.20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1麦芽糖；f.30 g·L-1白砂糖Fig.2 Growth of P.elliottii embryogenic callus in different carbon source and concentrationsa.30 g·L-1 sucrose；b.20 g·L-1 sucrose；c.30 g·L-1 brown sugar；d.45 g·L-1 maltose；e.20 g·L-1 sucrose+10 g·L-1 maltose；f.30 g·L-1 white sugar

表2 不同碳源成分及浓度对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响Table 2 Effects of different carbon source and concentrations on the embryogenic callus proliferation in P.elliottii

因此，市售精制白砂糖相比于纯蔗糖，更适宜湿地松胚性愈伤组织的增殖，但具体是其中的何种成分促进了增殖，还需进一步探索；而麦芽糖极不适宜湿地松胚性愈伤组织的增殖，即使浓度提高至45 g·L，也无法供给增殖所需的能量。

2.4 谷氨酰胺及其替代物丙谷二肽对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响

通过添加谷氨酰胺以及不同浓度的丙谷二肽，观察丙谷二肽能否替代谷氨酰胺用于胚性愈伤组织的增殖培养，结果表明，丙谷二肽添加后，即使增加使用浓度，培养后质量及增殖率均显著低于添加谷氨酰胺的处理组（见表3），说明丙谷二肽无法在湿地松胚性愈伤组织的增殖培养中替代谷氨酰胺。

表3 丙谷二肽及谷氨酰胺对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响Tabl 3 Effect of L-alanine-L-glutamine and L-glutamine on the embryogenic callus proliferation in P.elliottii

未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的处理组与添加谷氨酰胺的处理组相比，培养后质量及增殖率差异虽然略低，但差异不显著（见表3）；进一步在继代后观察到未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的处理组的胚性愈伤组织更容易褐化，多次继代后容易出现增殖困难和死亡，说明谷氨酰胺的缺乏即使在培养当代未显著影响增殖率，仍会潜移默化地影响胚性愈伤组织的细胞活力，使细胞活力降低。

3 讨论

胚性愈伤组织的增殖是松树体细胞胚胎发生的一个重要环节，胚性愈伤组织可在适当的培养基上长期继代培养，并具有发育为体细胞胚胎，萌发形成体胚幼苗的能力。影响针叶树胚性愈伤组织的增殖的因素有很多，其中包括碳源成分及浓度、微量元素、激素和琼脂的浓度、pH 等，并且这些因素一直是体胚细胞胚胎发生过程研究的重点。

2003 年，曹新祥等人综述了植物组织培养中pH 变化的有关问题：培养基的pH 能够影响细胞的分裂和细胞增殖，当环境pH 高于8 时可启动细胞的分裂，偏低则抑制细胞分裂；pH 还可影响植物材料的呼吸代谢状况、激素进出胞内和作用。目前，针叶树胚性愈伤组织及体细胞胚胎培养中常用的pH 是5.8，且通常在培养基灭菌前测定。在本研究结果中，胚性愈伤组织增殖培养的最适pH 在5.68～6.28，过酸过碱均会显著影响增殖率。他人的研究中所使用的pH=5.8也在该pH范围内，但本研究获得的最适pH 范围并不是培养基灭菌前测定的，而是灭菌后实际测得的pH。已有研究表明，培养基经过高温高压也会发生pH 改变，灭菌前培养基pH 在5～7 时，灭菌后pH 平均降低0.56。与该研究结果不同，在本研究中，不同的pH 范围在灭菌前后的变化并不是一致的：当灭菌前pH 在4.0～5.0 时，灭菌后pH 升高；当灭菌前pH在6.0～8.0 时，灭菌后pH 降低。因此，如何调节灭菌前pH 使灭菌后pH 能够落在最适pH 范围内，是一个极易被研究者忽略的细节问题。根据本研究结果，如灭菌前调节pH 至5.8，灭菌后pH 进一步降低至5.4 左右，并不适宜胚性愈伤组织的增殖；如灭菌前调节pH 至6.0～7.0，灭菌后pH 落在约5.68～6.28，更适宜胚性愈伤组织的增殖。

胚性愈伤组织在增殖时期，基本上不进行光合作用，需要额外添加碳水化合物作为能量。培养基中的碳源通常是由糖类提供。蔗糖是松属胚性愈伤组织增殖过程中最常用的碳源之一，常规使用浓度在10～30 g·L。在本研究中，使用20 g·L蔗糖时，增殖率略低于使用30 g·L蔗糖的处理组，说明在一定范围内提高蔗糖的浓度，能够提高湿地松胚性愈伤组织的增殖效率，与付双彬在油松中的研究结果相似。麦芽糖是针叶树体胚诱导和成熟过程的常用碳源，亦有研究者将其用于湿地松胚性愈伤组织的增殖。据报道，麦芽糖比蔗糖、葡萄糖更有利于胚性愈伤组织的诱导，或提高湿地松的成熟体胚获得率。在本研究中，麦芽糖并不适合湿地松胚性愈伤组织的增殖，在麦芽糖作为唯一碳源的培养基中培养，胚性愈伤几乎不能增殖；这与成熟培养中利用麦芽糖抑制胚性愈伤增殖的作用原理相一致，但与张彩云等利用麦芽糖作为湿地松增殖培养的碳源的报道不相符。本研究基于降低培养基成本方面考虑，还使用了市售精制白砂糖和红块糖作为碳源进行研究，并意外地发现白砂糖是最适宜湿地松胚性愈伤组织增殖的碳源。虽然白砂糖的主要成分是蔗糖，但同时还含有0.5%左右的其他成分，有可能对植物组织的生长产生负面影响。在杉木的组织培养中，用白砂糖代替蔗糖，对其组培苗生长并无影响，且大大节约了生产成本。这与本研究的结果类似，在湿地松胚性愈伤组织的培养中，也可利用精制白砂糖替代蔗糖以降低生产成本。

氮元素对于植物的生长发育是至关重要的，在针叶树的体胚生长发育过程中，所需的氮全部依赖培养基供给，且有研究表明，谷氨酰胺所提供的有机氮比无机氮更为重要。在挪威云杉胚性培养物的增殖过程中，观察到游离氨基酸库中67%的同化氮源均来自谷氨酰胺提供的氮。在挪威云杉的体胚萌发过程中，谷氨酰胺也是体胚萌发过程的首选氮源。可见谷氨酰胺提供的有机氮是胚性愈伤组织和体胚正常生长不可或缺的，但谷氨酰胺的水溶液极易水解，给培养基的配制和存放、胚性愈伤组织和体胚的培养和继代带来了诸多不便。在动物及人源细胞培养中，谷氨酰胺发挥的作用与体胚培养中类似，也是重要的有机氮来源和各类氨基酸∕维生素等的合成前体。目前已有研究表明，谷氨酰胺能够以L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的二肽形式或蛋白水解物的形式给细胞提供营养，其商品化的产品GlutaMAX被广泛应用于各种细胞培养中。在本研究中，也想尝试利用丙谷二肽替代谷氨酰胺进行胚性愈伤组织的培养，但目前结果表明，丙谷二肽不仅不能替代谷氨酰胺用于湿地松胚性愈伤组织的增殖培养，还会在一定程度上抑制增殖。该结果说明针叶树胚性愈伤组织利用谷氨酰胺的方式可能与动物细胞并不一致，胚性愈伤组织无法利用以二肽形式存在的谷氨酰胺，需要寻找其他可能的谷氨酰胺替代物以改进胚性愈伤组织的培养方法。

胚性愈伤组织的增殖是体胚发生过程中的一个重要阶段，一方面在此阶段要实现迅速扩增，另一方面其生长状态也会直接影响体胚的成熟比率和发育状态。本研究发现用于湿地松胚性愈伤组织增殖的培养基应在灭菌前调整pH 至6.0～7.0，使灭菌后pH 可落在5.68～6.28，选择30 g·L精制白砂糖或30 g·L蔗糖作为碳源，并添加450 mg·L谷氨酰胺，能够获得较优增殖效率，且胚性愈伤组织的生长状态较好。本研究初步探究了pH、碳源和谷氨酰胺对湿地松胚性愈伤组织增殖的影响，获得一些有趣的发现，后续研究中可进一步对碳源或谷氨酰胺的利用机制进行探索，以揭示胚性愈伤组织的碳∕氮利用规律，为进一步优化体胚发生体系奠定研究基础。