不同转化条件对3种农杆菌GFP基因在本氏烟草中瞬时表达的影响
2022-03-02张悦婧王娟娟庞海龙贾凌云冯汉青
张悦婧 李 颖 王娟娟 庞海龙 贾凌云 冯汉青
(西北师范大学生命科学学院,兰州 730070)
瞬时表达是指将外源基因以非整合的方式导入细胞,以在短时间内实现目的基因高水平表达的技术。由于瞬时表达不需要将外源基因整合到细胞的染色体上,并且不需要通过筛选,也不产生可稳定遗传的后代,故与稳定表达相比,瞬时表达具有简单、快速、周期短、效率高、生物安全性强等特点。因此,该技术在分子生物学研究中被广泛应用于外源基因的表达、启动子和抑制子功能分析、亚细胞定位、蛋白质间相互作用、转录因子与顺式作用元件的互作等方面。此外,该系统也用于药用蛋白的生产,为疫苗、抗体、生物制药的研发开辟了捷径。
通过瞬时表达在植物中导入外源基因的方法有基因枪法、电击法、聚乙二醇法、植物病毒介导法、农杆菌渗透法。其中,农杆菌渗透法操作简便,易于转染,表达效率高,可携带较大的外源基因片段,同时可以在完整植株上进行表达,因此使用农杆菌渗透法所介导的瞬时表达在上述方法中最为普遍和广泛。其基本流程为构建双元表达载体系统,将目的基因插入到Ti 质粒上的T-DNA上,形成重组质粒后转化农杆菌,然后利用农杆菌侵染植物叶片,通过辅助性质粒的Vir区基因与重组质粒T-DNA 区的反式作用激活T-DNA 的转移,从而将目的片段的基因转至植物细胞的细胞核中;由此,虽然大部分T-DNA 并未整合到植物基因组中,只是暂存在于核内,但仍然可利用植物细胞的转录、翻译系统对T-DNA 上携带的目的基因进行瞬间表达,达到短期基因表达的目的。
目前,常用的农杆菌菌株有LBA4404、EHA105、GV3101 等,主要来源于C58 和Ach5 菌株,其中EHA105、GV3101 菌株来源于C58,这类菌株生长速率快,在转化实验中易于操作,GV3101 菌株常用于构建病毒载体来研究农杆菌介导的瞬时表达以及病毒诱导的基因沉默(VIGS);而LBA4404 菌株来源于Ach5,研究发现该类型菌株会增加番茄(L.)和烟草(L.)植株肿瘤发生,进而促进遗传转化。已有研究表明,GV3101 和LBA4404 菌株通过产生细胞分裂素对植物免疫应答基因的激活有不同的作用。Diamos 等比较发现,农杆菌菌株EHA105 比GV3101 和LBA4301具有更强的侵染性。不同的农杆菌菌株是由其染色体背景和Ti 质粒决定的,这三种菌株都含有不同的非致瘤Vir辅助型质粒,并且主要是通过修饰Vir区的相关基因来影响T-DNA 转移的频率,所以不同的农杆菌菌株的毒力(侵染力)不同。近几年,利用这些菌株分别在拟南芥(L. Heynh)、番茄、绿豆(L.Wilczek)、葡萄(L.)等植物中进行瞬时表达分析,其中以C58 染色体为背景的菌株EHA105、GV3101等应用最为广泛。
一方面,不同农杆菌、以及农杆菌的浓度、侵染时间对瞬时表达效率的影响尚无明确报道。另一方面,近年来利用农杆菌介导的瞬时表达仍然存在蛋白质产量低等问题;目前提高外源蛋白质产量主要是从表达载体自身构成方面进行优化改进,而对农杆菌菌种以及浓度等的选择研究较少。基于此,本研究利用双元载体连接GFP 作为报告基因,以农杆菌注射侵染法为手段,分析了不 同 农 杆 菌(LBA4404 菌 株、EHA105 菌 株、GV3101 菌株)、菌液浓度以及侵染时间对GFP 荧光表达量的影响,从而为瞬转过程中农杆菌相关因素的查明和条件的优化等工作提供了有价值的信息。
1 材料与方法
1.1 植物材料的培养
将本氏烟草(L.)种子播种在育苗盘中的泥炭上,置于25℃、50%湿度的培养室中,以16 h∕8 h昼夜周期生长,当幼苗长出3~4片叶子后转移至空间较大的托盘中,培养5~6 周的烟草用于瞬时侵染。
1.2 菌液的制备
本实验中使用的农杆菌菌株由荷兰Wageningen 大学生物系统学实验室的Klaas Bouwmeester教授馈赠。将带有GFP 编码基因的双元转化载体质粒转化后的三种不同农杆菌(LBA4404 菌株、EHA105菌株、GV3101菌株)在含50 mg·L卡那霉素(Kana)、25 mg·L利福平(Rif)、25 mg·L氯霉素(Chl)的YEB 平板上划线复壮,无转化载体的三种对照菌株在仅含25 mg·L利福平(Rif)的YEB平板上划线复壮。次日挑取单菌落在含相同抗生素的YEB 液体培养基中28℃,180 r·min振荡过夜,将菌液移至5 mL 离心管中,4℃、5 000 r·min离心10 min 后弃上清收集菌液,加入浸润缓冲液(10 mmol·LMES-KOH,pH5.5、10 mmol·LMg-SO、100 μmol·L的乙酰丁香酮混合溶液)清洗菌体(去除残留的抗生素)。收集后菌体重悬于浸润缓冲液中,稀释菌体并测其对应的OD值来设置不同的浓度梯度(OD分别为0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0)。室温放置3 h用于侵染烟草叶片。
1.3 瞬时转化方法
选取大小、长势基本一致的烟草叶片,用5 mL无菌注射器吸取2 mL 菌悬液,取针头轻刺待注射的烟草叶片下表皮,将菌悬液缓慢注射到叶片中。每个浓度梯度注射2 个叶片,进行3 次重复实验。经注射后的烟草继续在培养室中培养,在侵染后第2、4、6 天用荧光体视镜(Leica,德国)检测叶片扩散区的绿色荧光表达量并拍照记录。
1.4 绿色荧光的定量分析
用Image J V1.8.0 软件分析荧光图片,所得数值均为3 次独立实验结果的平均值,数据用平均值±标准差表示。使用SPSS 20.0 软件对数据进行单因素方差分析,以<0.05 表示统计学上的显著性差异。
2 结果与分析
2.1 EHA105 菌液浓度和侵染时间对瞬时表达的影响
农杆菌在转化过程中,菌液浓度和侵染时间是影响外源基因表达的重要因素。将EHA105菌液设置5 个不同浓度梯度,在注射后的第2、4、6天依次观察绿色荧光蛋白的表达量。结果显示(见图2),随着侵染时间的延长,荧光表达量呈现先升高后下降的趋势。总体上,第4天表达量显著高于其它侵染时间组,并且菌液浓度为0.6 时,GFP 荧光表达量达到最大值,菌液浓度为0.4 和0.8 时表达效果相同(见图1);侵染后第2 天和第6天,菌液浓度分别为0.2、0.8和1.0时荧光表达量无显著性差异。因此,EHA105 菌株在浓度为0.6,第4天荧光表达量最高。
图1 EHA105菌液的GFP荧光表达量不同字母表示处理间差异显著(P<0.05);采用Image J 软件对不同浓度和不同侵染时间下GFP荧光表达量进行量化处理的结果;下同Fig.1 GFP fluorescence expression of EHA105 bacterial solutionDifferent letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level;Image J software was used to quantify the GFP fluorescence expression at different concentrations and different infection times;the same as below
图2 EHA105菌液在不同浓度和不同侵染时间下GFP荧光表达量A.3 种不同农杆菌的对照组;B.EHA105 菌液在不同浓度(OD600值分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)和不同侵染时间下(第2 天、第4 天、第6 天)GFP表达量的代表性图片Fig.2 expression of GFP in EHA105 bacteria at different concentrations and different infection timesA.Control group of 3 different Agrobacteria;B.Representative images of GFP expression in EHA105 bacteria at different concentrations(OD600 values were 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0)and at different infection times(day 2,day 4 and day 6)
2.2 LBA4404 菌液浓度和侵染时间对瞬时表达的影响
结果显示(见图4),随着LBA4404菌液浓度增加,GFP 荧光呈现增强的趋势,菌液浓度为0.8 时,荧光表达量达到最大值,然而当菌液浓度达到1.0时,GFP 表达量与峰值相比有所下降;在菌液注射后第2天,荧光表达量较高,随着侵染时间的增加,GFP 荧光表达量不断下降,但侵染后第4 天,菌液浓度为0.6 和0.8 的荧光表达量无显著性差异(见图3)。综合可见,LBA4404 菌株在浓度为0.8,侵染时间为第2天时GFP表达量最高。
图3 LBA4404菌液的GFP荧光表达量Fig.3 GFP fluorescence expression of LBA4404 bacterial solution
图4 LBA4404菌液在不同浓度和不同侵染时间下GFP荧光表达量LBA4404菌液在不同浓度(OD600值分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)和不同侵染时间下(第2天、第4天、第6天)GFP表达量的代表性图片Fig.4 expression of GFP in LBA4404 bacteria at different concentrations and different infection timesRepresentative images of GFP expression in LBA4404 bacteria at different concentrations(OD600 values were 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0)and at different infection times(day 2,day 4 and day 6)
2.3 GV3101菌液浓度和侵染时间对瞬时表达的影响
如图5 所示,GV3101 菌株整体荧光表达量较弱,但相比于对照组均能检测到荧光。菌液浓度为0.6 时,绿色荧光蛋白的表达量相对较高,其它的浓度组表达量较低;在菌液注射后的第4 天,荧光表达量最强,菌液浓度为0.2 和0.4 以及0.8 和1.0 时,荧光表达量无明显差异(见图6)。因此GV3101菌株在浓度为0.6,侵染后第4天荧光表达量较高。
图5 GV3101菌液的GFP荧光表达量Fig.5 GFP fluorescence expression of GV3101 bacterial solution
图6 GV3101菌液在不同浓度和不同侵染时间下GFP荧光表达量GV3101菌液在不同浓度(OD600值分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)和不同侵染时间下(第2天、第4天、第6天)GFP表达量的代表性图片Fig.6 expression of GFP in GV3101 bacteria at different concentrations and different infection timesRepresentative images of GFP expression in GV3101 bacteria at different concentrations(OD600 values were 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0)and at different infection times day 2,ay 4 and day 6)
从以上研究结果可以看出,在注射后的第2天均能检测到绿色荧光蛋白,但不同的菌株荧光表达量差异明显,第6天后烟草叶片基本检测不到荧光。对GFP 荧光量化处理后的结果(图1、图3 和图5)与图片中观察到的结果一致。选择3 种农杆菌菌株荧光表达量最高的浓度和时间组合,对比发现LBA4404 菌株的荧光表达量最高,分别是EHA105 和GV3101 菌株表达量的1.4 和3.8 倍(图7),GV3101菌株表达量最低。
图7 3种不同农杆菌菌株的GFP荧光表达量分别选取3种不同农杆菌菌株荧光表达量最高的浓度和时间组合进行比较,EHA105菌株(OD600=0.6,第4天);LBA4404菌株(OD600=0.8,第2天);GV3101菌株(OD600=0.6,第4天)Fig.7 expression of GFP in 3 different agrobacterium strainsThe concentration and time combinations with the highest fluorescence expression of 3 different Agrobacterium strains were selected for comparison,EHA105 strain(OD600=0.6,day 4);LBA4404 strain(OD600=0.8,day 2);GV3101 strain(OD600=0.6,day 4)
3 讨论
瞬时表达在合成和生产外源重组蛋白的过程中扮演了重要的角色,较之传统的细菌、酵母、动物细胞表达系统,利用植物作为生物反应器生产重组蛋白不仅能够保证蛋白质翻译后修饰和加工等过程,而且成本低廉。因此,植物瞬时表达系统为高效、快速表达疫苗抗原或药用蛋白提供了一个新的平台,然而,目前如何提高植物体内蛋白质产量是瞬时表达研究的重点和难点之一。目前,诸多研究集中于对表达载体的转录或翻译原件的改造,而对农杆菌相关因素的分析较少,因此本研究以瞬时表达体系的常用模式植物本氏烟草和3种常用的农杆菌进一步分析了农杆菌菌株、浓度、侵染时间等要素对瞬时表达体系的影响。
通过实验发现,本研究所用的3种菌株均能在烟草中瞬时表达基因,而对照组的3 种农杆菌几乎无荧光出现(见图2A)。但每种菌株在植物中转化条件有所不同,体现在不同的菌株在转化后GFP 荧光达到最高表达效率的OD值和时间有所不同。Sheludko 等认为农杆菌介导的瞬时转化中最适菌液浓度OD在0.1~1.5,但显然这是一个较为宽泛的范围。我们的研究结果显示,EHA105 和GV3101 菌 株 的OD值 为0.6 时,GFP 表达量最高,而LBA4404 菌株与其它两种菌株不同,OD值在0.8时,GFP 荧光表达量最强,然而当菌液浓度达到1.0 及以上时,荧光表达量有下降的趋势,同时烟草叶片也会有泛黄的状态,这可能揭示了农杆菌浓度过高或过低,都会影响外源基因的表达效率;菌液浓度过低不能实现农杆菌的有效转化,而菌液浓度过高会对植物的生理或细胞活力产生一定的损伤,可能会影响植物细胞的转录或翻译能力,进而影响了外源基因的表达水平。
已有研究表明,农杆菌侵染时间同样会影响表达效率,侵染时间过短,农杆菌不能有效转化,侵染时间过长又会严重影响植物的生理状态。本研究也发现,随着侵染时间的增加,EHA105 和GV3101 菌株在第4 天荧光表达量最强,在侵染后第6 天GFP 荧光表达量出现下降的趋势,但是LBA4404菌株在第2天荧光表达量最强,之后呈现出下降的趋势。这说明每种农杆菌介导外源基因的瞬时表达的表达峰值有所差异,因此,农杆菌菌株、浓度以及侵染时间均是影响瞬时表达的重要条件。
由于这3 种农杆菌菌株的遗传背景和携带的Ti 质粒不同,以上所观察到的差异的内在分子机制应和3 种农杆菌菌株的遗传背景和携带的Ti 质粒密切相关。但有趣的是,Zottini 等用3 种不同的农杆菌菌株LBA4404、GV3101 和AGLl 浸润不同的葡萄品种表达GFP 基因,结果表明菌株之间并无差异。而本研究发现,LBA4404 菌株相比于EHA105和GV3101菌株在本氏烟草叶片中GFP表达效率最高,EHA105菌株次之,GV3101菌株瞬时表达效率最低。这表明不同农杆菌菌株的确会影响外源基因的瞬时表达效率,但也和所使用的植物有关。因而推测,植物和农杆菌的亲和性或是互作关系在很大程度上会影响瞬时表达过程中植物对根癌农杆菌菌株的敏感性,并由此影响瞬时转化效率。此外,据报道,在农杆菌转化植物过程中,当细菌附着到植物细胞上之后,Ti 质粒上Vir 编码的基因能够帮助转移和整合T-DNA 到植物细胞中。而VirG 是根癌农杆菌中VirA∕VirG两组分系统的响应调节剂,可响应植物宿主信号介导Vir基因的表达,可以影响农杆菌在植物中的转化效率。因此我们推测,不同农杆菌介导的外源基因瞬时表达效率不同也可能与它附着在植物细胞上的能力以及农杆菌中Ti 质粒上Vir 基因的差异有关。综上所述,农杆菌菌株是影响瞬时表达的重要条件,从而决定了获得最高外源基因表达量的菌株工作浓度和时间,但本研究所观察到的现象的内在分子机制还有待进一步查明。