长白落叶松转录因子LobHLH34克隆及表达分析

杨宇宁 董 昊 董实伟 王乃锐 宋 跃 张含国 李淑娟

（林木遗传育种国家重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040）

落叶松（spp. Mill.）具早期速生、抗逆性强、轮伐期短等优势，是东北地区三大针叶用材树种之一。长白落叶松（）又称朝鲜落叶松，为松科（Pinaceae）落叶松属（）的落叶乔木，作为北半球所独有的一种针叶用材树种，广泛分布在我国东北以及华北的高山地区，是东北地区的优良乡土树种，在干旱且寒冷的困难立地条件下其抗逆性和适应性较其他树种更强。目前该树种已建立高效的体胚发生及悬浮培养体系。因此，它是进行落叶松抗逆基因克隆和机制研究的理想材料。

bHLH（basic∕helix-loop-helix）是植物中最大的转录因子家族之一，它存在于真核生物中，由两个保守区域构成：碱性区域和bHLH（螺旋—环—螺旋）区域，前者含有大量碱性氨基酸，主要参与DNA 的结合；后者由疏水氨基酸残基构成，利于HLH 之间相互作用形成二聚体。植物基因组中包含许多转录因子，其中WRKY、NAC、CBF、MYB、AP2∕EREBP 等均参与非生物胁迫应答且被广泛研究。而bHLH 转录因子家族的研究相对滞后。玉米（）中的和基因是植物界中最早发现的转录因子，随后研究者对水稻（L.）和拟南芥（）等模式植物进行了系统深入的研究。通过全基因组测序及生物信息学分析发现在拟南芥及水稻中bHLH 转录因子的家族成员分别有164 和180个，拟南芥的系统发育树中将bHLH转录因子家族分为12 个亚家族，水稻中将其分为22 个亚家族。它们在植物生长发育、形态建成、花器官形成、激素应答、次生产物代谢和抗逆性等方面发挥了重要作用。目前关于bHLH 类转录因子参与植物逆境响应的研究已有一些报道，如发现一些bHLH转录因子受低温、高盐、干旱、缺铁及缺磷等胁迫的诱导表达。研究表明，水稻在干旱胁迫下表达量显著增高，在转录水平调节下游靶基因茉莉酸信号途径相关基因的表达，进而调节植株对干旱胁迫的耐受程度。在拟南芥中，和通过降低PP2Cs 编码基因的表达来响应干旱胁迫。

本研究以长白落叶松为材料，根据长白落叶松转录组数据中获得的基因全长序列设计引物，克隆长白落叶松基因并对其进行生物信息学分析，同时对该基因在长白落叶松不同器官中的表达特异性及不同类型非生物胁迫下的表达特性进行分析，旨在为后续探究该基因在长白落叶松中的功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与主要试剂

植物材料：供试的长白落叶松种子选自黑龙江鸡西种源，选取种皮饱满、表面有光泽的长白落叶松种子，用流水冲洗3～5 d，选取沉在底部的优势种子播种于温室苗盘内，基质为V（草炭土）∶V（蛭石）=1∶1 的营养土，浇透水覆膜保湿，培养条件为温度25±1 ℃，16 h 光照∕8 h 黑暗，湿度为75%。其间隔天掀开喷水通风1 次，培养30 d 左右，当针叶完全伸开时，选取长势一致的小苗移入直径10 cm的培养钵中，每盆1 株，继续培养3 个月左右。进行亚细胞定位的材料为温室内生长8 个月的野生型毛果杨（）木质部原生质体。

主要试剂：cDNA 反转录试剂盒购于百泰克公司；PCR酶KOD FX购于东洋纺（上海）生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒和质粒小提试剂盒购于Omega Bio-tek 公司；限制性核酸内切酶和T4DNA 连接酶购于NEB（北京）有限公司；荧光定量试剂盒购于全式金生物技术有限公司。琼脂糖购于北京沃比森科技有限公司；DL 2000 DNA Marker购于biosharp公司。

1.2 菌株与载体

大肠杆菌感受态DH5α 购于北京全式金生物技术有限公司；农杆菌感受态GV3101为本实验室保存；VB191103-1905rcy 载体菌种和pUC19-GFP载体均为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室提供。

1.3 试验方法

1.3.1 长白落叶松总RNA 提取与cDNA 第一链的合成

取苗龄4个月左右的长白落叶松土培苗全株，经无菌水冲洗、吸干表面水分后加液氮迅速研磨成粉末，采用CTAB 法提取植株总RNA，用超微量紫外分光光度计（产品型号：Micro Drop）检测RNA的浓度，用1%琼脂糖凝聚胶电泳检测RNA 完整性，最终获得RNA 模板。再根据cDNA 反转录试剂盒的操作说明，在PCR 仪上进行反转录，合成cDNA第一链，并放在-20 ℃冰箱内保存备用。

1.3.2 长白落叶松基因的克隆与特异引物设计

从长白落叶松转录组数据库中获得基因的全长序列，基因的开放阅读框为696 bp。利用Primer5.0 软件设计引物（见表1），引物由上海生工生物有限公司合成。以整株的RNA反转录所得的cDNA 为模板，采用KOD-FX PCR 酶进行PCR 扩增，克隆出基因的全长片段。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequence

PCR 反应体系（50 μL）：ddHO 10 μL，2x PCR buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol·LdNTPs 10 μL，上下游引物各1.5 μL，模板cDNA 1 μL，KOD FX 1 μL，扩增条件：94 ℃2 min，98 ℃10 s，58 ℃30 s，68 ℃42 s，35个循环；68 ℃10 min；16 ℃保温。

PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用DL2000 DNA Marker 比对扩增得到的目的片段长度，确认正确后，使用胶回收试剂盒对扩增产物进行胶回收，操作步骤与方法参考试剂盒说明书。胶回收后用HⅠ、Ⅰ限制性内切酶将基因和载体同时双酶切，后将目的片段与VB191103-1905rcy 载体连接，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37 ℃过夜培养后挑取单菌落进行PCR 检测，将目的条带大小正确的菌株送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。

1.3.3基因的生物信息学分析

根据的序列，依据各类生物信息在线工具和软件进行分析。利用NCBI 在线软件分析该基因的开放阅读框，使用在线工具CLUSTALW 将获得的核苷酸和氨基酸序列与NCBI 中已登录的其它物种进行序列比对和同源性分析，结合MEGA 5.0 软件构建系统进化树，并对蛋白质进行理化性质分析、保守结构预测、亲水性疏水性、二级结构与三级结构分析，具体方法见表2。

表2 生物信息学分析网站及软件Table 2 Websites and softwares for bioinformatics analysis

1.3.4 LobHLH34亚细胞定位分析

选取温室内生长8个月的野生型毛果杨，以木质部原生质体为材料进行亚细胞定位。将基因序列构建到pUC19-GFP 载体上，成功构建该基因的融合绿色荧光蛋白（GFP）瞬时表达载体；使用pUC19-H2A-mCherry 作为细胞核定位标记，用100 mL 2×YT 培养基进行摇菌大提质粒，至质粒浓度达到2000 ng·μL。质粒与细胞核定位的瞬时表达载体与毛果杨木质部分离出来的原生质体进行共转化并过夜培养，次日通过荧光显微镜进行镜检观察。

1.3.5 长白落叶松基因的组织特异性表达检测

选取4 月苗龄的生长状态良好且长势一致的长白落叶松植株，以每3 株幼苗为一组样本，分别进行盐胁迫，干旱胁迫及ABA 处理，设置3 次生物学重复。

分别配置200 mg·LNaCl、40%的PEG和50 mg·LABA 水溶液浇灌长白落叶松土培苗，每盆中的溶液等量，使溶液完全浸透土壤。以上3种胁迫处理分别在0，12，24，48 和96 h 五个时间点取样，0 h 为对照组。根、茎、叶分别取样，取材后立即用液氮处理并放于-80℃冰箱保存。分别提取根、茎、叶的RNA，反转录成cDNA，荧光定量PCR 仪（ABI Prism7500 型）进 行qRT-PCR 分析该基因在长白落叶松不同组织中的特异性表达。

根据基因序列设计特异定量引物-FQ 及-RQ，以tubulin 基因为内参设计正向引物tubulin-F 及tubulin-R（见表1），以胁迫处理后获得的根、茎和叶cDNA为模板，进 行qRT-PCR 分 析。反 应 体 系：2×TransStartTOP∕Tip Green qPCR Supermix 10 μL、-QF∕QR 引 物（10.0 μmol·L）各0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，加ddHO至20 μL。PCR反应程序如下：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃35 s，40次循环；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃30 s。每个cDNA 模板均进行3 次生物学重复，利用2法进行数据处理，计算基因的相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 长白落叶松总RNA 的检测及LobHLH34 基因的克隆

以长白落叶松为材料提取的总RNA 经1%琼脂糖电泳检测，有明显的18 s RNA、28 s RNA 两条条带和微弱的5 s RNA 弥散状条带，且28 s RNA的亮度为18 s RNA 的两倍（见图1A），提取的总RNA质量完好可用于后续试验。

利用在线软件https：∕∕www.arabidopsis.org∕，运行Blast 工具将该基因的ORF 与模式植物拟南芥对比，比对结果显示该基因与拟南芥转录因子家族的相似度最高，因此命名为。利用长白落叶松总RNA反转录成的cDNA为模板，利用特异性引物对基因ORF 序列进行扩增，PCR 结果显示与目的片段大小基本一致（见图1B）。将菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果正确，可以进行后续操作。

图1 长白落叶松总RNA和扩增产物电泳图Fig.1 The electrophoresis of total RNA in L.olgensis and PCR production

2.2 长白落叶松LobHLH34基因生物信息学分析

2.2.1 蛋白质的一级结构分析

ExPAsy 分析结果显示，长白落叶松基因蛋白分子式为CHNOS，完整的开放阅读框（ORF）长度为696 bp，共编码231 个氨基酸（见图2）。该基因蛋白分子量为26.09 kDa，在组成蛋白的20 种氨基酸中，脯氨酸（Pro）和丝氨酸（Ser）所占比例最高，均占9.1%，半胱氨酸（Cys）所占比例最低，占1.3%。含有带负电的氨基酸（Asp+Glu）和带正电的氨基酸（Arg+Lys）个数分别为33 和34 个，理论等电点（pI）为7.73，脂溶指数61.73，总平均亲水系数为-0.830，不稳定系数为67.17；且该蛋白中第64 位亲水性最强，得分为-3.156，第114 位疏水性最强，得分为1.867，推测该蛋白为不稳定的酸性亲水蛋白（见图3）。

图2 LobHLH34基因序列及推测的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and predicted amino acid sequences of LobHLH34

图3 LobHLH34蛋白的亲/疏水性分析预测Fig.3 Analysis pro-/hydrophobic of LobHLH34

2.2.2 蛋白质的二级结构预测与分析

采用在线软件SOPMA 对长白落叶松氨基酸序列的二级结构进行预测。结果表明，含α-螺旋（Alpha helix）101个，占43.72%；β-转角（Beta turn）2 个，占0.87%；延伸链（Extended strand）1个，占0.43%；无规则卷曲（Random coil）127 个，占54.98%（见图4）。

图4 LobHLH34蛋白二级结构预测Fig.4 Predicion of secondary structure of LobHLH34

2.2.3 蛋白质三级结构预测与分析

蛋白质的三级结构是在二级结构的延伸基础上进一步盘绕和折叠。采用SWISS-MODEL 工具，运用同源建模法对基因编码蛋白进行三级结构建模（见图5）。其中建模范围是83～166个氨基酸，序列对比一致性为30.95%。

图5 LobHLH34蛋白三级结构预测Fig.5 Prediction of tertiary structure of LobHLH34

2.2.4 蛋白保守结构域分析

利用NCBI 中的在线工具Conserved Domain Search Service（CD Search）对LobHLH34 蛋白的保守结构域进行预测（见图6），结果表明，保守区包含从75 位至150 位的氨基酸，该基因属于bHLHSF superfamily家族，包含ILR3保守结构域。

图6 LobHLH34蛋白结构域预测Fig.6 Protein domain prediction of LobHLH34

2.2.5基因的进化树分析

用MEGA 5.0 软件通过近临相接法（Neighbor-Joining）构建蛋白序列的进化树，由系统进化分析表明，长白落叶松和云杉的距离最为接近，和其他植物均相差较远（见图7）。

图7 LobHLH34系统进化树分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of LobHLH34

2.3 长白落叶松LobHLH34的亚细胞定位分析

为了解是否是典型的转录因子，在细胞核表达功能，构建了基因融合绿色荧光蛋白（GFP）瞬时表达载体。结果如图8 所示：基因融合GFP发出的绿色荧光与细胞核定位的H2A基因融合mCherry发出的红色荧光完全重叠，重叠区域显示出黄色的光。表明转录因子是核定位蛋白，符合转录因子的特征。

图8 LobHLH34亚细胞定位分析Fig.8 Subcellular localization of LobHLH34

2.4 长白落叶松LobHLH34基因的表达模式分析

2.4.1基因在长白落叶松不同器官下的表达模式

分别以长白落叶松根、茎、叶为模板，通过qRT-PCR 检测分析基因在长白落叶松各器官的相对表达量（见图9）。结果表明：基因在落叶松各个器官中均有表达，以茎中的相对表达量为参照，叶中的相对表达量最高，约为茎中的10 倍，根的相对表达量约为茎中的2倍。

图9 LobHLH34基因不同器官的表达分析Fig.9 Expression analysis of LobHLH34 gene in different organs

2.4.2基因在长白落叶松逆境胁迫下的表达模式

为更深入了解长白落叶松基因的生物学功能，本研究对其进行了NaCl、PEG和ABA处理，采用qRT-PCR 分别对基因在根、茎、叶中的表达情况进行了初步分析。结果表明：Na-Cl、PEG 和ABA 等非生物胁迫均对基因的相对表达量产生不同程度的影响。在NaCl胁迫后，落叶松根中基因表达量呈现升高—降低—升高的趋势，不同时间点之间的表达量差异显著。其中，在12 h 时表达量达到最高，是对照的2.7倍；在茎中该基因的表达量在所有时间点均为上调表达，12 h时表达量最高；在叶中该基因表达量呈现先降低后上升的趋势（见图10）。推测该基因在植物体不同器官中的调控模式不同；在PEG 胁迫下，落叶松根和茎中该基因的表达量在所有时间点均表现为上调表达，其中根部表达量呈持续升高的趋势；在茎中表达量短时间内迅速升高而后迅速降低，但始终高于对照，24 h时表达量最高，为对照的27倍；在叶中该基因的表达量先下降后上升，在12 h时表达量最低，然后呈逐渐升高的趋势（见图11）。分析该基因可能参与渗透胁迫应答，然而在不同器官中的响应模式不同；在ABA处理后，根部各个时间点的表达量与对照相比差异显著，呈现出明显的先上升后降低的趋势，24 h时表达量达到最高，为对照组的12倍；茎的表达量在12 h时变化不大，在24 h时表达量迅速升高；叶在12 h时先迅速降低，后逐渐升高，在96 h时表达量与对照基本持平（见图12）。

图10 NaCl 胁迫下LobHLH34 在长白落叶松不同器官中的相对表达量（P＜0.05）Fig.10 Relative expression of LobHLH34 in different organs of L.olgensis under NaCl stress（P＜0.05）

图11 PEG 胁迫下LobHLH34 在长白落叶松不同器官中的相对表达量（P＜0.05）Fig.11 Relative expression of LobHLH34 in different organs of L.olgensis under PEG stress（P＜0.05）

图12 ABA 胁迫下LobHLH34 在长白落叶松不同器官中的相对表达量（P＜0.05）Fig.12 Relative expression of LobHLH34 in different organs of L.olgensis under ABA stress（P＜0.05）

3 讨论

研究发现转录因子主要参与干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫以及矿质元素铁和磷胁迫的的逆境响应调控。在长白落叶松中克隆获得基因，共含696 bp 的CDs 序列，编码231 个氨基酸。预测该基因所编码的蛋白只包括ILR3保守结构域，为非跨膜运输，不稳定的酸性亲水蛋白。该基因所编码蛋白的二级结构由α-螺旋（43.72%），无规卷曲（54.98%），β-折叠（0.87%），延伸链（0.43%）组成。选取了云杉等14 种植物的基因序列进行多序列比对及进化树分析，结果表明长白落叶松与云杉相似性最高。

qRT-PCR 研究发现，基因在长白落叶松根、茎、叶中都有表达，在叶中的表达量最高，在茎中的表达量最低，表明该基因可能参与叶的光合作用或气孔的发育过程，并影响了落叶松的组织特异性表达，而且在NaCl、PEG 及ABA 胁迫下，其表达量的变化趋势各不相同：在NaCl 处理下，落叶松根和茎部表达量在12 h 迅速升高，在叶中却呈下降趋势；在PEG 胁迫下落叶松各器官的表达量始终上调表达，但程度不一样，这与烟草（）基因在干旱胁迫下表达量始终高于对照的结果相符；在ABA 处理下，根部的表达量开始迅速升高，在24 h 时达到最大值，为对照的12倍，茎部的表达量在12 h时变化很小，在24 h 才开始上升，叶在12 h 时表达量迅速降低后基本与对照持平。叶在这3 种胁迫下，在12 h 时表达量与对照相比均存在显著差异，表明该基因在叶中能够较快的做出逆境胁迫响应，初步分析认为，落叶松基因的表达可能参与NaCl、PEG 胁迫和ABA 处理的应答，但在不同胁迫下响应模式有所差异。基因在响应NaCl、PEG 和ABA 的过程中调控途径及作用机制还有待进一步分析和验证。