竹节参总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的实验研究

杨 煜，闻 宇，王友联，吕文伟，康劲松*，李洪岩*

(1.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院,吉林 长春130041)

心肌缺血可导致心律不齐甚至心力衰竭等严重的并发症，成为对人类健康构成严重威胁的疾病之一。竹节参总皂苷主要皂苷成分是竹节参皂苷IV、V和人参皂苷Re等，具有显著降低中动脉栓塞模型大鼠全血粘度、红细胞聚集性及增加红细胞变形性的功效[1-2]，能够明显增加Bcl-2蛋白表达，减少Bax蛋白表达，减少凋亡，改善大鼠神经功能的受损程度[3]。缺血再灌注时氧自由基生成增多，对蛋白质、核酸及细胞外基质产生破坏[4-6]，高能磷酸化合物缺乏，总腺苷酸水平减少，同时钙超载，形成磷酸钙损伤线粒体功能，使 ATP 产生障碍。本试验从心肌酶学、心肌细胞凋亡[7]及超微结构方面观察竹节参总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)模型的治疗作用。

1 资料与方法

1.1 实验资料

1.2 实验方法

Wistar大鼠50只，随机分为假手术组、模型组、地奥心血康50.0 mg·kg-1组、竹节参总皂苷50.0 mg·kg-1及100.0 mg·kg-1组，灌胃一周，每天一次。大鼠用乙醚麻醉罐麻醉后，鼠板上仰卧位固定，在心脏周围剪毛、消毒并做荷包缝合，在左侧第3肋间开胸，暴露心脏，用大鼠扩胸器将心脏挤出胸腔，迅速结扎左冠状动脉前降支1/2处，将心脏迅速送回胸腔，用力挤出胸腔内血液和空气，收拢荷包关闭胸腔。假手术组仅留线，不结扎左冠状动脉前降支。30 min后开胸，剪断结扎线造心肌缺血再灌注损伤模型。120 min后，大鼠腹主动脉插管取血，3 500 r/min，离心10 min，取上清液测定AST、LDH、MDA、SOD、GSH- Px含量。取心尖及左室心肌组织制成1×109/L 细胞悬液，加 Annexin-V-FITC室温避光反应10 min，加PI混匀室温避光反应 5 min，于1 小时内用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡指数。切取一小块梗死区心肌组织，经4%戊二醛固定，磷酸盐缓冲液冲洗，1%锇酸后固定，蒸馏水冲洗，乙醇、丙酮由低浓度到高浓度梯度系列脱水，环氧树脂浸透包埋，高温聚合后，半薄切片定位到心肌纵切面，再进行超薄切片，最后经醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重电子染色，透射电子显微镜下观察超微结构的改变。

2 结果

2.1 竹节参总皂苷对大鼠血清AST，LDH活性及心肌细胞凋亡指数的影响

模型组大鼠血清AST、LDH及心肌细胞凋亡指数均明显高于假手术组(P<0.001)，说明心肌缺血再灌注损伤模型制备成功。地奥心血康50.0 mg·kg-1组和竹节参总皂苷50.0 mg·kg-1、100.0 mg·kg-1组与模型组比较，AST分别降至模型组含量的70.4%、72.7%和66.7%(P<0.05、P<0.05、P<0.001)。LDH的含量分别降至模型组含量的71.4%、76%和66.1%。(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。心肌细胞凋亡指数则分别比模型组下降了20%、25.9%和27.5%(P<0.001、P<0.05、P<0.001)，具有统计学意义，说明竹节参总皂苷能够明显减轻心肌缺血再灌注造成的心肌损伤，结果见表1。

表1 竹节参总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注 AST，LDH活性及心肌细胞凋亡指数的影响

2.2 竹节参总皂苷对大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px的影响

从表2中可以看出 模型组血清MDA水平与假手术组相比较明显升高(P<0.001)，SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.001、P<0.01)。给予地奥心血康50.0 mg·kg-1及竹节参总皂苷50.0 mg·kg-1、100.0 mg·kg-1后，MDA水平明显降低(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，而SOD及GSH-Px活性明显升高(P<0.05、P<0.05、P<0.05)。

表2 竹节参总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注 MDA、SOD、GSH-Px的影响

2.3 竹节参总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞超微结构的影响

假手术组心肌细胞肌膜连续，于Z线处下陷，肌丝束排列整齐，肌节的结构清晰，线粒体嵴致密、结构清晰,沿长轴整齐地排列在肌丝束之间。模型组心肌细胞胞膜破损，肌丝束排列紊乱、可见广泛的断裂溶解改变，有的心肌细胞胞质内肌节合并形成异常的收缩带，线粒体移位，局部空化，也有部分线粒体呈完全的肿胀空化状态。与模型组相比较，地奥心血康组心肌细胞超微结构改善明显，除部分肌丝束仍有轻微断裂改变外，大部分肌丝束排列整齐,肌节及明暗带结构清晰，线粒体数量略有减少，但未见空化改变。竹节参总皂苷50.0 mg·kg-1组心肌细胞仍可见部分肌丝束呈轻微断裂改变，肌丝排列松散,肌节及明暗带结构尚可，线粒体基质疏松，局部可见空化改变。竹节参总皂苷100.0 mg·kg-1组大部分心肌细胞内均可见到整齐排列的肌丝束,肌节及明暗带结构清晰，线粒体嵴结构清晰，基质略显疏松。

3 讨论

MIRI发生时，由于能量代谢障碍产生大量氧自由基，自由基进一步损害线粒体，造成线粒体功能障碍，加重能量代谢障碍。这种恶性循环是造成MIRI心肌组织损伤和细胞死亡的重要原因[8]。实验中观察到大鼠心肌缺血再灌注后，模型组大鼠血清中心肌酶AST和LDH含量明显增加，说明有大量的心肌细胞发生损伤，与李玲美等结果一致[9]。而竹节参总皂苷能够明显降低血清中AST和LDH的含量，说明竹节参总皂苷能够减轻缺血再灌注造成的心肌细胞损伤。

大量研究表明，组织缺血再灌注过程中生成的大量自由基可以进一步加剧组织的损伤，使细胞的膜结构和功能遭到破坏。SOD和MDA是目前公认的能反映氧化应激反应程度的指标[10]。MDA是生物膜脂质过氧化反应的代谢产物，其含量间接反映机体组织氧化应激状态。SOD可直接清除超氧阴离子，是维持机体氧化还原平衡状态的重要抗氧化酶之一，GSH-Px 具有保护细胞膜的结构及功能不受损害的作用，这些抗氧化酶是体内抗氧化的第一道防线。实验结果显示，与模型组相比，竹节参总皂苷可明显降低血清MDA的含量，增加血清SOD、GSH-Px的含量。说明竹节参总皂苷可能通过增加SOD、GSH-Px的含量，减少缺血再灌注过程中生成的自由基对细胞膜结构和功能的破坏，进而实现对心肌细胞膜结构和功能的保护作用，。在缺血早期细胞凋亡数量甚至多于细胞坏死数量，缺血再灌注过程中心肌细胞超微结构与细胞凋亡呈现相关性[11-12]。模型组大鼠心肌细胞在缺血再灌注后，心肌细胞凋亡指数显著增高，心肌细胞的超微结构也明显破坏，可见心肌细胞膜破损，肌丝束广泛的断裂溶解，线粒体空化。给予竹节参总皂苷后，心肌细胞的凋亡指数明显下降。心肌细胞的超微结构也得到了明显的改善，心肌细胞中仅可见部分肌丝束呈轻微断裂改变，肌节及明暗带结构尚可，线粒体未见明显的空化改变。说明竹节参总皂苷能够保护心肌细胞的超微结构及减少细胞的凋亡发生。

综上所述，竹节参总皂苷能够保护心肌细胞超微结构，减轻心肌的缺血再灌注损伤，其作用机制可能与清除氧自由基，降低脂质过氧化，减少心肌细胞凋亡有关。