波形蛋白表达与联合检测血清CA19-9在肝门部胆管癌的临床意义

王 石,夏医君,胡志伟,王 磊,佟根喜,王 鹏*

(1.内蒙古自治区人民医院 肝胆胰脾外科，内蒙古 呼和浩特010010;2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特010010)

被称为Klatskin瘤(Klatskin tumor)的肝门部胆管癌(Hilar cholangiocarcinoma，HCCA)，在胆道系统中是最为常见的一种恶性肿瘤，主要发生的部位是左肝管、右肝管、左右肝管分叉部以及肝总管位置[1]。此肿瘤在胆管黏膜下层沿胆管壁纵向生长，透壁性浸润并向胆管周围的其它组织呈放射状扩散，同时伴有对神经的侵犯以及淋巴结的转移[2]。波形蛋白(Vimentin，VIM)作为Ⅲ型中间丝纤维蛋白，它的变化能够使多数肿瘤细胞骨架和细胞外基质发生重排、重塑，从而获得间质细胞特征,使得细胞形态发生改变，获得侵袭转移能力，细胞侵袭性增强[3]。糖类抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是临床上较为实用的一种肿瘤标志物，CA19-9的检测对某些肿瘤的诊断以及肿瘤组织的大小及分期的预测具有一定的临床意义[4]。本实验通过免疫组织化学染色方法检测波形蛋白在肝门部胆管癌的表达及分析血中CA19-9水平在肝门部胆管癌的临床意义。

1 实验材料及方法

1.1 实验对象

VIM的实验对象：实验组为收集2010年12月-2020年12月期间因“HCCA疾病”于内蒙古自治区人民医院肝胆外科住院行根治性手术切除的存档组织蜡块60例，对照组为癌旁组织60例(经病理科专家镜下确定为无癌细胞的胆管组织)；所有标本均经病理科专家显微镜下确诊，出具报告单，标本4%甲醛固定，石蜡包埋，编号存档。实验组取标本入组时的标准：①经手术切除的组织经病理确诊为HCCA；②术中均留取HCCA组织作为标本；③有完整临床及随访资料；④术前均未接受化疗或放射治疗；⑤年龄性别不限。排除标准：①围术期死亡者；②临床资料不完整者；③合并有严重的心肝肾肺疾病以及精神疾病者；④合并其他恶性肿瘤者；对照组取标本时纳入标准：①标本经病理科专家镜下确定为无癌细胞的胆管组织；②有完整临床及随访资料；③术前均未接受化疗或放射治疗；④年龄性别不限。排除标准：①围术期死亡者；②临床资料不完整者；③合并有严重的心肝肾肺疾病以及精神疾病者；④合并其他恶性肿瘤者；

CA19-9的实验对象：实验组同上(按条件选择的60例HCCA患者)；对照组为按条件选择的60例胆总管结石患者；其中60例胆总管结石患者的入组标准是：①有完整的临床病理资料；②患者经手术或临床确诊为胆管良性疾病；③无其他系统恶性肿瘤或是良性疾病。排除标准为：①围术期死亡者；②临床资料不完整者；③合并有严重的心肝肾肺疾病以及精神疾病者；④合并其他恶性肿瘤者。

1.2 实验方法

通过免疫组化方法分别检测60例肝门部胆管癌癌组织及癌旁组织中波形蛋白的表达，并分别收集实验组及对照组各个患者入院术前的血清CA19-9数值(单位为U/mL)，做好记录。

1.3 IHC结果的判定

免疫组织化学结果分析：在医学光学显微镜下进行评分，以细胞质内出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为VIM阳性细胞，按视野中阳性细胞染色比例进行评分，再按染色程度进行评分。根据细胞染色强度进行评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按染色比例进行评分：未着色为0分，1%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，76%-100%为4分。染色强度与染色比例的乘积为最终评分，最终评分<3分为低表达，≥3分为高表达。

血清CA19-9水平分析：CA19-9≥39 U/mL 为阳性(高水平)，CA19-9<39 U/mL 为阴性(低水平)。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件分析相关数据，计量资料采用χ2检验，相关性分析采用SPEARMAN秩相关进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在HCCA癌组织及癌旁组织中VIM表达的情况

在本实验中：(1)实验组(即HCCA患者癌组织)中VIM呈高表达者：43例患者；(2)对照组(即HCCA患者癌旁胆管组织)中VIM呈高表达者：23例患者；VIM在HCCA癌组织及癌旁组织中的高表达率分别为71.7%和38.3%，表达程度的差异性显著，具有统计学意义(P=0.001<0.05)，见图1。

图1 镜下：在HCCA组织中VIM的高表达为A图(×200倍，×400倍)，低表达为B图(×200倍，×400倍)；在癌旁正常胆管组织中VIM的高表达为C图(×200倍，×400倍)，低表达为D图(×200倍，×400倍)。

2.2 HCCA患者中VIM表达的程度与各临床病理参数的关系

在本实验中，通过60例癌组织切片检测VIM表达程度与各临床病理参数的相关性分析如下：

(1) 年龄≥60岁的患者癌组织中波形蛋白的阳性表达率高于<60岁的患者，两组有显著的差异性(χ2=19.86，P<0.05)，有统计学意义；肿瘤直径≥2 cm的波形蛋白表达率高于肿瘤直径<2 cm的患者，具有显著的差异性(χ2=20.86，P<0.05)，在统计学中有意义；低分化患者的癌组织中波形蛋白的阳性表达率显著高于中、高分化患者(χ2=10.86，P<0.05)，差异有统计学意义；在淋巴转移为阳性的患者中波形蛋白的阳性表达率高于淋巴转移阴性的患者，两组有显著的差异性(χ2=17.93，P<0.05)，在统计学中有意义；在肿瘤TNM分期中的T分期里：在T3/T4期中波形蛋白的阳性表达率高于T1/T2期，两组有显著的差异性(χ2=18.61，P<0.05)，在统计学中有意义；血管侵犯为阳性的患者中VIM的阳性表达率高于血管侵犯为阴性的患者，两组有显著的差异性(χ2=7.07，P<0.05)，在统计学中有意义。

(2)其中HCCA中的VIM表达程度与患者性别、神经侵犯的相关性均无显著的统计学差异(χ2=3.10、1.05，P>0.05)。

2.3 HCCA患者及所患良性胆管疾病(胆总管结石)患者血清中的术前CA19-9水平

在本实验中：(1)实验组(即HCCA患者)中术前的血清CA19-9水平明显为高(阳性)：40例患者；(2)对照组(即：胆总管结石患者)术前的血清CA19-9水平明显为高(阳性)：25例患者；CA19-9在HCCA患者及胆总管结石患者中的阳性率分别为66.7%和41.7%，其水平高低程度有明显的差异，此差异具有统计学意义(P=0.006<0.05)。

2.4 HCCA患者血清CA19-9水平程度与临床病理参数的关系

本实验通过收集60例HCCA患者相关数据，研究HCCA患者术前血清中CA19-9水平与各组临床病理参数之间的相关性：

(1)年龄≥60岁的HCCA患者中CA19-9水平的阳性率高于<60岁的患者，两组的差异性明显(χ2=6.34，P<0.05)，具有统计学意义；肿瘤直径≥2 cm患者的CA19-9水平的阳性率高于肿瘤直径<2 cm的患者，具有显著的差异性(χ2=32.175，P<0.05)，在统计学中有意义；低分化患者的CA19-9水平的阳性率高于中、高分化患者，差异性显著(χ2=19.86，P<0.05)，有统计学意义；在淋巴转移为阳性的患者中CA19-9水平的阳性率高于淋巴转移阴性的患者，两组有显著的差异性(χ2=16.15，P<0.05)，有统计学意义；在肿瘤TNM分期中的T分期里：在T3/T4期中CA19-9水平的阳性率高于T1/T2期，两组有显著的差异性(χ2=35.71，P<0.05)，有统计学意义；血管侵犯为阳性的患者中CA19-9水平的阳性率高于血管侵犯为阴性的患者，两组有显著的差异性(χ2=25.65，P<0.05)，有统计学意义；神经侵犯阳性的患者中CA19-9的阳性率高于神经侵犯阴性的患者，两组有显著的差异性(χ2=6.54，P<0.05)，在统计学中有意义。

(2)术前CA19-9水平与患者性别的相关联性没有统计学差异(χ2=0.54，P>0.05)。

2.5 HCCA患者中VIM表达和血清中CA19-9水平的关联性

对60例HCCA患者中VIM和CA19-9的关联性进行分析，结果显示：在HCCA患者，VIM的高表达与血清CA19-9高水平(阳性)成正相关，具有统计学意义，(相关系数r=0.34，P=0.008)，提示VIM的表达与术前血清中CA19-9的水平呈现协同作用。

2.6 预后分析(生存分析)

2.6.1单因素分析 (1)使用Kaplane-Meier法进行分析后显示，HCCA患者中VIM的高表达和术前血清中CA19-9的高水平(阳性)与患者的预后不良明显相关(Log Rank=14.350,P=0．000；Log Rank=32.592,P=0．000)，在统计学中有意义。

(2)此外，年龄≥60岁、肿瘤大小≥2 cm，肿瘤低分化、淋巴转移阳性、肿瘤TNM分期中的T分期为T3/T4、血管侵犯阳性等因素与患者预后差相关(Log Rank=4.898，P=0.027；Log Rank=19.833,P=0.000；Log Rank=10.705，P=0．001；Log Rank=21.822，P=0．000；Log Rank=28.742，P=0．000；Log Rank=25.516，P=0.000)，同时具有统计学意义。

(3)预后情况与患者的性别、神经侵犯不相关(Log Rank=0.160,P=0．689；Log Rank=3.212,P=0．073)，无统计学意义。

2.6.2多因素分析 将影响HCCA患者预后的单因素变量(P<0.05)纳入COX多因素分析证实：影响HCCA患者根治性切除术后生存时间的独立危险因素为VIM高表达、CA19-9阳性、淋巴转移阳性、血管侵犯阳性，具有统计学意义，见表1。

表1 影响实验组对象(60例HCCA患者)预后的多因素分析

3 讨论

HCCA是一种最难治疗的肿瘤之一，具有侵袭性肿瘤生物学特性，手术切除目前是治疗的理想方法，但是由于肿瘤大小、淋巴转移、血管及神经侵犯等病理因素的影响，多数患者手术切除率低，复发率高，生存期短[5]。因此对HCCA的早期诊断在患者后期进一步的治疗中具有重要意义。多种肿瘤标记物(如血清糖类抗原19-9、糖类抗原125和癌胚抗原等)的联合检测可有效的预测HCCA，但由于血清学的检测易受多种因素的影响，在临床应用中相对受限；对于这种难治疗的肿瘤，我们应不断通过科研来提高其诊断及治疗方式，改善预后，为患者带来福音。目前，由于肿瘤诊断过程的烦琐、费用昂贵等因素致使HCCA的早期诊断无法顺利进展。因此,在人体体液内检测肿瘤细胞分泌的靶基因可能作为一种无创的、高度可靠的诊断方式出现在临床中。

波形蛋白(Vimentin，VIM)是上皮向间充质过渡(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)的标志，在促进肿瘤细胞的发展、迁移、侵袭过程中起着重要的作用。有研究表明，间充质特征与疾病复发、转移、肿瘤进展和预后恶化的倾向显著相关，而VIM正是一种在间充质细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞)中组成性表达的Ⅲ型中间丝蛋白。VIM的高表达影响着晚期肿瘤分期及预后，VIM在多种恶性肿瘤(如乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌和卵巢癌)的癌组织中都呈现高表达状态[6]。本次实验中，通过免疫组化方法检测结果分析，发现VIM在HCCA癌组织中表达程度明显高于癌旁组织，对比差异显著，具有统计学意义(P<0.05)；并且通过分析VIM与HCCA患者的多种临床病理因素的关系，得知VIM的高表达与HCCA患者的年龄≥60岁、肿瘤大小≥2 cm明显相关，同时与肿瘤低分化、淋巴转移阳性、肿瘤TNM分期中的T分期(T3/T4)、血管侵犯阳性等因素也相关联，在统计学中均有意义(P<0.05)；与患者的性别、神经侵犯并无明显相关性，也无统计学意义(P>0.05)。本实验结果充分表明，VIM在HCCA的发生和发展中起着极大的作用。研究发现EMT是细胞获得逃逸能力的过程，是从上皮层侵入间质并形成转移灶的过程，VIM作为其标志性分子，与多种肿瘤的预后有着密切的关系[7]。本实验结果也表明，在HCCA患者中，VIM表达高的患者比表达低的患者的生存时间明显要短，再次证实了VIM对HCCA患者的预后不良起着重要的作用。从而进一步推测VIM将来可以作为一种生物标记物，被用来评估和预测患者术前和术后生存情况。

糖类抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是在临床上应用价值很大的一种肿瘤标志物，应用于多种恶性肿瘤患者的检测[8]。其在胆管癌的诊断和预后检测中的作用被大家一致认可。已有研究表明术前 CA19-9 高水平是胆管癌患者预后不良的独立因素，在胆管癌的诊断中，其灵敏性也较高[9-10]。本实验中，通过收集实验组与对照组二组中受检对象的血清CA19-9数值，进行统计结果分析，发现CA19-9在HCCA患者中的水平明显高于良性胆管疾病(胆总管结石)患者，对比差异显著，具有统计学意义(P<0.05)；并且通过分析可知：CA19-9的高水平(阳性)与HCCA患者的多种临床病理因素(即年龄≥60岁、肿瘤大小≥2 cm、肿瘤低分化、淋巴转移阳性、肿瘤TNM分期中的T分期(T3/T4)、血管侵犯阳性及神经侵犯阳性)明显相关联，有统计学意义(P<0.05)；而与性别无明显相关，无统计学意义(P>0.05)。本实验结果表明，在HCCA中，血清中CA19-9水平高(阳性)的患者比水平相对低(阴性)的患者的生存时间短，这证实了在HCCA患者的预后中，术前血清CA19-9高水平作为一个相对独立的危险因素影响着HCCA患者的预后。在将来，血清CA19-9可能会被用于对早期HCCA的监测以及评估和预测患者术前和术后生存情况。

本实验研究在HCCA患者中VIM表达与血清中CA19-9水平情况的相关性进行分析后得知，VIM表达与血清中CA19-9的水平存在明显的正相关性，这表明在HCCA的发生、发展过程中，VIM与CA19-9起着协同作用。实验结果显示，在HCCA患者中高表达的VIM和高水平的CA19-9与患者的临床病理因素(如年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴转移、肿瘤TNM分期中的T分期、血管侵犯等)相关。同时也证实了VIM高表达、CA19-9高水平、淋巴转移阳性、血管侵犯阳性等可作为独立危险因素影响HCCA患者的预后。

在HCCA患者中，我相信通过不断对VIM及血清中CA19-9的研究，VIM与CA19-9的联合检测将来可为HCCA患者的早期诊断提供一个可靠的依据，同时也可为该疾病的靶向治疗领域提供一个新的治疗手段。

作者简介：王石，内蒙古自治区人民医院肝胆胰脾外科主任医师，硕士研究生导师;王鹏，内蒙古自治区人民医院，肝胆胰脾外科医师。