基于网络药理学探讨益母草马齿苋治疗异常子宫出血的作用机制

秦璐璐，刘文琼

（1.山东中医药大学中医学院，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院妇科，山东 济南 250014）

异常子宫出血（abnormal uterine bleeding,AUB）是指与正常月经的周期、经期及经量中的任何一项不符、来源于宫腔的异常出血[1,2]。有资料显示，AUB在生育期妇女中约占l/3，其中20%~50%为功血[3,4]。AUB发病率及就诊率较高，且存在病因及发病机制复杂、治疗局限及复发率高的问题，成为严重危害女性健康的疾病之一。目前西医对AUB的治疗较为局限，以激素及手术治疗为主，人群接受率较低，所以迫切需要从中医药中寻找安全有效防治AUB的药物。

益母草（Leonurus japonicus Houtt）在《雷公炮制药性解》中曾记载：“味辛甘，性微寒，无毒，入诸阴经，本功治血”，且具有“行血而不伤新血，养血而不滞瘀血”的特点。益母草作为妇科常用药物，被称为“妇科经产之要药”。现代药理学研究发现，益母草具有双向调节子宫收缩活动、防止凝血、激素调节、调节子宫肌电、保护子宫内膜、促进子宫内膜复旧和抗子宫内膜炎等作用[5,6]。马齿苋（Portulaca oleracea L.）作为中国传统的药食同用的药物，具有毒副作用小的特点，《唐本草》载其可：“破血癖症癖”，《滇南本草》中其有“催生下胎、疗痔疮红肿热痛”的作用，现在药理研究发现马齿苋不仅有抗炎、抗氧化的作用，而且对子宫具有兴奋作用，任何剂量均不会引起子宫肌强直收缩，故马齿苋的临床应用安全范围较大[7-9]。益母草和马齿苋在临床上治疗异常子宫出血应用颇多，且药量变化灵活，故本文以益母草马齿苋作为研究目标，运用网络药理学方法筛选出该药对的主要药物活性成分，构建“药物成分靶点通路”网络，预测该药对治疗AUB的对应靶点及信号通路，从新的层面探讨益母草马齿苋治疗AUB的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 提取益母草-马齿苋的药物有效成分及靶点

在TCMSP分析平台（https://tcmspw.com/tcmsp.php）上，以生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%[4]和类药性（drug likeness,DL）≥0.18[5]为条件指标，并检索《中药词典》及相关文献，筛选益母草及马齿苋的化学成分，选择“Related Targets”一栏，导出结果，提取中药有效成分所对应的靶点，把获取的益母草马齿苋的中药成分及其对应的靶点通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）选出作用靶点的标准基因名。

1.2 提取AUB疾病相关基因

将“Abnormal uterine bleeding”分别在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://omim.org/）中输入，从而得到AUB相关的靶点基因。

1.3 获取益母草-马齿苋和AUB疾病靶点的交集

把益母草马齿苋药物靶点和AUB疾病靶点运用相应脚本，通过R 64 4.0.2软件（https://www.r-project.org/）得到AUB疾病和益母草马齿苋药物交集靶点的韦恩图。

1.4 构建中药-有效成分-疾病-靶点调控网络

将1.2中获得的益母草马齿苋药物靶点和1.3中获得的益母草马齿苋和AUB交集靶点通过Perl脚本得到相应网络关系，然后对该网络通过Cytoscape3.7.2软件（https://cytoscape.org/）进行可视化呈现，得到中药 成分 疾病 靶点调控网络图，图中的节点具体代表了中药、有效成分、疾病和靶点，连线代表了上述节点之间的作用联系。

1.5 建立中药-疾病靶点蛋白互作网络并选取核心基因

将中药-疾病靶点输入STRING 11.0在线软件（http://string-db.org/cgi/input.pl），条件选为homo sapiens（human），保存所得结果，将所得结果输入R 64 4.0.2软件，从而获得蛋白互作网络核心靶点的条型图。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

运用R 64 4.0.2软件计算中药疾病靶点，获得GO功能富集分析结果（表2、图5和图6）和KEGG通路富集分析结果（表3、图7、图8和图9）。

1.7 分子对接技术验证中药活性成分与核心基因的结合活性

运用分子对接技术，选择中药的3个特征性活性成分与蛋白互作网络中排名前3的靶点进行分子对接，通过PubChem找到中药的化合物结构，导入Chem3D软件对其空间结构进行优化，通过RCSB PDB下载蛋白受体结构，使用AutoDock Tools 1.5.6对化合物进行去水、加氢和加电荷处理，根据配体的位置以及蛋白活性位点的坐标进行分子对接研究，通过结合能的大小对活性成分与靶点之间的结合活性进行评价，并用PyMOL进行分析作图。

2 结果

2.1 益母草-马齿苋药物有效成分及靶点信息

通过TCMSP数据库（以OB≥30%和DL≥0.18为条件）检索《中药词典》及相关文献，对益母草-马齿苋共筛选出19个药物有效成分（其中益母草10个、马齿苋12个，共有成分3个）（见表1），汇总去重后，获取929个药物靶点，通过UniProt数据库检索，其中仅有455个靶点可找到对应的标准基因名，然后利用R 64 4.0.2软件将上述获得的455个标准基因名与GeneCards和OMIM数据库中获得的AUB相关基因进行匹配，最终得到92个共同靶点，将其作为候选靶点（见图1）。

图1 益母草-马齿苋中药成分作用靶点和AUB靶点韦恩图Fig.1 Venn plots of the AUB targets and action targets of the motherwort-purslane

表1 益母草-马齿苋药物有效成分及其筛选参数Table 1 Active components and screening parameters of Motherwort and Portulaca oleracea

2.2 构建中药-有效成分-疾病-靶点调控网络的结果

Cytoscape构建调控网络，得到114个节点（其中药物2个，核心有效成分19个，疾病1个，靶点92个）和761条线（图2）。结果显示，芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、杨梅黄酮和益母草碱等化合物可能是益母草马齿苋治疗异常子宫出血发挥治疗作用的核心化合物。

图2 中药-成分-疾病-靶点调控网络Fig.2 TCM-component-disease-target regulatory network

2.3 建立中药-疾病靶点蛋白互作网络并选取核心基因的结果

根据图3、图4可知，中药疾病核心基因按邻接节点数目从多至少按顺序为IL6、INS、ALB、CASP3、EGFR、VEGFA、MAPK8、MYC、ESR1、CCND1、ERBB2、FOS、CYCS、AR、CASP8、RELA、CTNNB1、MDM2、PPARG、NOS3、ICAM1、MCL1、CASP9、CAV1、PGR、HIF1A、AHR、PARP1TNFRSF1A和CCNB1等，邻接节点数目越多，越有可能成为核心基因。

图3 中药-疾病靶点蛋白互作网络Fig.3 TCM-disease target protein interaction network

图4 中药-疾病核心靶点的条图Fig.4 The bar chart of TCM core disease targets

2.4 GO功能富集分析结果

GO功能富集分析结果，见表2。通过GO功能富集分析共得出114条生物过程，选取P值最小的20条生物过程制作柱状图和气泡图（见图5和图6），其中类固醇结合、泛素样蛋白连接酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合描述因子结合及DNA结合转录激活剂活性等生物过程中靶点较为集中。

图5 GO功能富集分析柱状图Fig.5 histogram of GO functional enrichment analysis

图6 GO功能富集分析气泡图Fig.6 Bubble diagram of GO functional enrichment analysis

表2 GO功能富集分析结果Table 2 GO functional enrichment analysis results

2.5 KEGG通路富集分析结果

KEGG通路富集分析结果，见表3和图9。122条信号通路从KEGG富集分析中得出，选择P值最小的20条信号通路制作柱状图和气泡图（见图7和图8），靶基因主要集中在脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路和TNF信号通路等。

图8 KEGG通路富集分析气泡图Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

图9 KEGG通路分析图Fig.9 The KEGG pathway analysis diagram

表3 KEGG通路富集分析结果Table 3 Results of the KEGG pathway enrichment analysis

图7 KEGG通路富集分析柱状图Fig.7 The histogram of the KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接

选择中药的3个特征性活性成分芹菜素、杨梅黄酮和益母草碱与蛋白互作网络中排名前3的靶点蛋白（IL6、INS和ALB），利用AutoDock软件进行分子对接，结果见表4、图10和图11。本次对接用结合能来评价活性成分与蛋白的相互作用强度，若结合能＜0，表明配体分子均能和受体蛋白自发结合，结合能小于﹣20.92 kJ moL-1，表示有较好的结合活性，且数值越小结合活性越强[10]。结果显示芹菜素与INS、ALB的结合能力均最强，IL6与杨梅黄酮的结合能力最强。

图10 芹菜素与ALB分子对接模式图Fig.10 Apigenin and ALB docking pattern diagrams

图11 杨梅黄酮与IL6分子对接模式图Fig.11 Myricetin and IL6 docking pattern diagrams

表4 益母草马齿苋特征性活性成分与核心靶点的分子对接结果Table 4 Molecular docking results of the characteristic active components of Herba Leonuri and Portulaca oleracea with core targets

3 讨论

异常子宫出血西医病因复杂，如宫腔内膜息肉、子宫平滑肌瘤、子宫腺肌病、排卵功能障碍和凝血相关疾病等都可导致AUB的发生，中医称为“崩漏”，多是由于肾虚、脾虚、血热及血瘀等病因导致冲脉任脉损伤，不能约束经血所致，在治疗上，西医较为单一，且远期疗效欠佳，复发率较高，中医则采用“急则治其标，缓则治其本”的原则，提出了“塞源”、“澄源”、“复旧”的“治崩三法”，中医药采用辨证论治的原则，临床治疗效果较好，因其独特的价值，临床挖掘潜力巨大。

本文以益母草马齿苋药为研究对象，在最终得到的19个核心有效成分中，以芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、杨梅黄酮和益母草碱与疾病的关系最为密切。芹菜素具有抗氧化、抗炎特性，通过控制自噬以改善组织损伤[11]；杨梅黄酮可增强免疫功能，抑制细胞因子，改善心功能不全，具有抗肿瘤潜能[12]；槲皮素的止血疗效是通过抑制血小板激活因子与抗血小板聚集发挥作用，此外，槲皮素还有较强的防氧化、抗炎和清除氧自由基的作用[13-17]；Chen等[18]发现木犀草素可以减少脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）对小白鼠肺泡MH-S细胞刺激而产生的促炎症因子、肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素6（IL-6）、炎症介质一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2），减少炎症因子和过量的活性氧对机体造成的损伤，另外，它还具有免疫调节、抗肿瘤作用、抗激素和抗氧化的作用[19,20]；山柰酚是一种黄酮类化合物，通过调节炎症相关蛋白表达、抑制转录因子激活等方式减少炎症因子的发生、发展，且还具有防氧化、防癌抗癌及抗病毒等多种疗效[21-24]；益母草碱可减少药物流产后子宫出血量并缩短出血时间，减少宫内残留，通过改善下丘脑垂体卵巢轴（HPOA）、增加雌二醇含量，进而改善子宫异常出血[25]。

此外，益母草马齿苋与异常子宫出血的核心基因很可能是IL6、ALB、VEGFA、CASP3和EGFR。IL6（白介素-6）作为一种细胞因子，对B淋巴细胞的成熟以及炎症过程起重要的作用，有研究证明在子宫内膜病变过程中常伴有白介素-6的过分表达[26,27]；ALB（白蛋白）具有维持血浆胶体渗透压的作用，另外ALB作为一种非专一性的载体蛋白，能可逆性地与体内许多难溶性的小分子有机物和无机离子进行结合，利于这些物质在血液循环中运行，黄敏[28]研究发现，白蛋白可以运输紫杉醇作用于肿瘤细胞，从而能使紫杉醇发挥更强大的抗肿瘤效果；有研究表明，VEGFA（血管内皮生长因子）在围绝经期子宫平滑肌肌瘤合并AUB患者的子宫内膜组织中具有过分表达，且与BFGF相互调控，促进子宫内膜增长并导致异常出血；另一项研究表明子宫腺肌病和宫腔内膜息肉的发病原因之一可能是血管的异常生成，已有研究证实VEGFA的过分表达和异常出血的发生呈正相关的关系[29,30]；CASP3（胱天蛋白酶3）是一种与细胞凋亡密切相关的酶，有研究证明Caspase-3的低表达可能促使细胞抗凋亡的能力增强，从而导致细胞凋亡减少而增殖过度，这可能是子宫内膜异常增生的发病机制[31]；EGFR（表皮生长因子受体）具有酪氨酸激酶活性，通过与EGF结合，进而促进细胞分裂增殖。有研究结果显示，子宫内膜癌变组织、子宫内膜非典型增生组织和正常子宫内膜组织中EGFR的阳性比率分别是74.4%、38.1%和18.4%，EGFR在由正常子宫内膜细胞向子宫内膜癌变细胞转变过程中起到了至关重要的作用[32]。

GO富集分析包括类固醇结合、泛素样蛋白连接酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合描述因子结合和DNA结合转录激活剂活性等多种生物学过程。在KEGG富集分析中，结果表示靶基因主要集中在PI3K-Akt、MAPK、糖尿病并发症中的AGE-RAGE和TNF等信号通路上。PI3K-Akt信号通路主要参与体内细胞的分化、增殖和凋亡过程，PI3K被激活后会募集并激活下游的信号分子Akt，Akt被激活后会促使mTOR和NF-B的活化，活化后的磷酸化底物会促使细胞的增殖，另外，PI3K/AKT及其关键因子PI3K、AKT与血管的生成密切相关[33]；MAPK信号通路可以被炎性因子、细胞因子及物理应激等刺激所激活，从而诱导炎性细胞及其他细胞的增殖与分化；还有研究发现，MAPK信号通路的激活与子宫内膜容受性和蜕膜的形成密切相关[34-36]；糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路可激活核转录因子-B（NF-B），刺激VEGF和TGF-1的产生，诱导MCP-1的表达，从而引起慢性细胞活化和组织损伤，增加血管的通透性，进而促进多种趋化因子、炎症因子及黏附因子的释放，如MCP-1、白细胞介素-1等，从而导致机体的损伤[37]。通过本次KEGG富集分析得到的AGE-RAGE信号通路图中可以看到，益母草马齿苋可能通过激活下游不同的效应蛋白如JNK、NF-B和Bcl-2等，进而调控下游的靶蛋白如IL-6、VEGF、casp3等对AUB起到治疗作用；TNF信号通路是一个炎症诱导细胞因子通路，TNF信号主要由其细胞膜受体TNF-R1和TNF-R2介导，研究表明TNF家族的细胞因子主要通过激活NF-B途径诱导和调节炎症、细胞存活、增殖和分化基因的快速转录，NF-B可以通过TNF-信号通路促进卵巢癌变细胞的增殖和转移[38,39]，在本次KEGG富集分析中得到的TNF信号通路图可能是通过激活下游不同的效应蛋白如JNK和NF-B等，进而调控下游的靶蛋白如炎症细胞因子IL-6、细胞内信号因子NF bia、转录因子Fos及细胞黏附因子Icaml等对异常子宫出血起到治疗作用。本文通过分子对接技术验证了益母草马齿苋两味中药的特征性活性成分芹菜素、杨梅黄酮、益母草碱与IL6、INS、ALB具有较强的结合活性，进一步说明了益母草马齿苋对AUB具有较大的临床治疗潜力。

综上所述，本文通过网络药理学和分子对接技术，得出益母草马齿苋可能是通过多成分、多靶点和多通路的方式对异常子宫出血起到相应的治疗作用，初步对益母草马齿苋治疗异常子宫出血作用机制进行了阐述，这也为以后临床应用益母草马齿苋提供了客观依据。