苗药叶上花茎和根的显微鉴别

宋梦姿，蒋艳洲，路瑀璠，罗春丽※

（1.贵州大学贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.华中科技大学同济医学院药学院，湖北 武汉 430030；3.黔西南州义龙蓝天学校，贵州 兴义 562400）

叶上花[Helwingia japonica(Thunb.)Dietr.]是山茱萸科青荚叶属的落叶小灌木[1]，全株可作药[2,3]，又被称为叶上珠、叶上果等。和平时常见植物的开花结果不同，叶上花的花果都长在叶片上，一般在中间叶脉靠近叶柄的位置，开花部位特殊且花的美感性强，因此，在药用价值和观赏价值方面都引起了人们的广泛关注，成为了一种难得的、可以进行关注开发的药用植物。

显微鉴别方法作为中药鉴别方法之一，被许多学者用来鉴别药材的真伪、优劣及纯度等。如李俊松等[4]利用性状和粉末显微鉴别等将百部科百部属中块根外形极为相似的3个物种区分。高敏等[5]用粉末显微鉴定方法对2005版《中国药典》收录的5个品种淫羊藿进行分析，最终以叶片非腺毛和上表皮细胞特征作为鉴别依据。覃挺红等[6]通过性状、显微鉴别方法比较易混淆的6种紫珠属植物叶片，对其紫珠属叶类药材的利用提供重大意义。

叶上花作为苗族习用药材，目前开展的相关研究极少；同时，由于西南少数民族地区特殊的地形和文化传播方式，造成了叶上花在流传过程中易混品种较多，不利于叶上花的研究、开发和利用[7-12]。因此，以苗族习用叶上花为研究对象进行了植物形态、根、茎及粉末的显微鉴别，以期为其进一步系统生药学鉴别及合理应用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验条件

实验地点：贵州省药用植物繁育与种植重点实验室；贵州大学农学院中药药剂学实验室。

实验材料：材料来源于贵州省毕节市七星关区清湾村野生的叶上花。

仪器设备：石蜡切片机（YD-201A型，浙江省金华市益迪医疗设备有限公司）；生物组织烤片机（YD-B型，浙江省金华市益迪医疗设备有限公司）；荧光显微镜（OLYMPUS DP73型，日本Olympus公司）；体视显微镜（Nikon SMZ800型，日本尼康公司）；电热鼓风干燥箱（101-3AB型，天津市泰斯特仪器有限公司）。

实验试剂：无水乙醇（重庆川东化工有限公司）；二甲苯、冰乙酸和甘油（天津市风船化学试剂科技有限公司）；苯酚、碱性品红和水合氯醛（天津市致远化学试剂有限公司）；甲醛（西陇科学股份有限公司）；丙酸（上海麦克林生化科技有限公司）；番红花红T（天津市科密欧化学试剂有限公司）；固绿（北京索莱宝科技有限公司）；明胶（天津市福晨化学试剂厂）；龙胆紫（中国上海远航试剂厂）。实验所用FAA固定液、FPA固定液、1%番红染液、0.5%固绿染液、黏片剂、软化剂均为按比例自行配制试剂。

1.2 实验方法

根据国内外文献和药用植物相关的书籍对青荚叶、中华青荚叶、浙江青荚叶、峨眉青荚叶和西域青荚叶的形态描述及分布，对比植株本身，确定其植株的来源。从整体植株形态对本次实验材料进行描述，并观察各部分的大小、性状、颜色及断面的特征。

研究所用的叶上花的茎和根使用FAA或FPA固定液进行固定，固定时间为24h，采用石蜡切片技术[13,14]对叶上花的茎和根进行制片，切片的厚度为8m。用番红 固绿染液（对染法）[15]对制好的叶上花茎的横切片进行染色；用碱性品红 龙胆紫[16]染液（二重染色法）对叶上花的根进行染色，根据实际情况适当调节脱水、浸蜡时间[17]，对于木质化严重的部位可以进行软化[18,19]。装片用荧光显微镜（OLYMPUS DP73型）和体视显微镜（Nikon SMZ800型）观察，选择符合要求、相对清晰的图片进行拍照。

2 结果与分析

2.1 来源鉴定

根据已知药用植物相关书籍与文献[20,21]中对青荚叶、中华青荚叶、浙江青荚叶、峨眉青荚叶和西域青荚叶的形态描述及分布情况可知：青荚叶属的植物喜爱荫蔽环境，且耐湿润，我国拥有的青荚叶属植物有5种，且大多品种分布于四川、云南境内，尤其是中华青荚叶和西域青荚叶。根据《中国植物志》中对5种青荚叶的叙述可知：中华青荚叶属于落叶小灌木，叶片背面颜色比正面浅，为浅绿色；叶片为线状披针形、狭披针形，叶不如其他4种青荚叶的叶宽；叶缘的短刺为腺状具细锯齿等不同特征，对比植株本身确定实验材料为中华青荚叶。

图1 叶上花性状图Fig.1 The characteristic of Helwingia japonica

观察并记录中华青荚叶的各部位外观性状如下：叶上花植株全株高可达1~3 m，属落叶的小灌木。叶上花的根为直根系，主根为近圆柱状，表面较粗糙，有栓皮和皮孔，质重坚实，折断面纤维性，形成层环纹内的木质部发达。茎为攀缘茎，呈圆柱形，直径为0.3~1 cm，存在木质化现象的主茎表面呈深棕紫色，颜色随着茎的幼嫩程度而逐渐变深绿，表面无毛，具有纵纹和少量纹孔，木质茎质硬而韧，不易折断，嫩茎断面有黏质液体。叶片为披针形，质感为革质或近革质，两面均光滑无毛，叶片背面颜色较正面浅，叶片互生，叶尖端略骤尖，叶基呈楔形，叶缘呈睫毛状，具有短刺，叶脉为羽状网脉，主叶脉靠近叶柄部分呈暗紫色，其余部分呈深绿色，越靠近植株顶端，叶生长越密集。花朵开在靠近叶柄部分的主叶脉上，花瓣一般为3片，为卵形的排列方式；雌雄异株，雄花的花梗极短，为伞状花序，花药3~5个；雌花无花梗[20]；花期4~5月，果落后会留下果梗残基。

2.2 茎的横切面显微结构

实验材料所用的叶上花的茎属于幼嫩部位，所用材料的直径约为1 890m，切片（图2）中看到的是茎的初生构造，周皮不发达，可以看出茎的表皮、皮层、髓和维管束等部分[22]。

图2 叶上花茎横切面图（左：100x；右：60x）Fig.2 Stem cross section diagrams of Helwingia japonica(Left:100x;Right:60x)

表皮细胞单列，由长方形扁平细胞紧紧相连并规则排列而成，切片中可能存在皱缩现象影响观察效果，观察到表皮细胞的细胞壁略微加厚，即存在角质化现象；皮层由多层球形、多面体等不规则形状细胞组成，实验中皮层宽度约为273m；越接近维管柱细胞越大，细胞壁越薄，多数为薄壁细胞，没有表皮细胞排列的紧密度高，内含棕色物质，可以观察到草酸钙方晶，接近表皮细胞部分细胞较小，存在厚角组织，可以加强茎的韧性；维管束宽约128m，射线明显，每个维管束之间的束间区域距离较大。初生韧皮部则位于维管束的外部，与薄壁细胞相邻，不能明显看出界限。初生木质部则位于维管束的内侧，与髓部紧挨，界限也不明显；束中形成层不太明显，维管束正在生长延伸阶段，整个形成层连接成环。以上韧皮部、木质部和束中形成层3部分共同构成维管束。实验材料的髓部直径约为1 060m，髓部相对较大，约占据整个实验材料面积的31%。由不同大小、近似六边形的细胞不规则排列组成，大多为薄壁细胞，髓中心的细胞相对于周围的细胞体积更大、细胞壁更薄。

2.3 茎的粉末鉴定

叶上花的茎的干燥粉末在自然光下显现为黄白色。多见草酸钙结晶和导管等结构[23]。

如图3所示，叶上花茎的粉末显微图可以观察到以下内容：表皮细胞为不规则的多边形，细胞壁增厚，内含有棕色物质，并具有纹孔。导管是由管胞分化而来，在叶上花木质部中导管和管胞有同时存在的现象，二者分子短小，但导管数量略多于管胞，直径可达70m。导管多呈具缘网纹状和螺旋状，两端不尖锐凸起；管胞多为梯纹管胞，两端稍凸起，直径稍小于导管直径；草酸钙结晶呈多面不规则长方体，判断为草酸钙方晶，一般以单个或几个散在的形式存在；淀粉粒较多，一般在10m以下，较大的淀粉粒可以看到层纹；韧皮部射线明显。

图3 叶上花茎的荧光显微镜粉末鉴定图（400x）Fig.3 Stem powder identification charts of Helwingia japonica(400x)observed by the fluorescence microscope

2.4 根的横切面显微结构

叶上花根整体呈圆形或近圆形，实验材料的直径约为1 872m，具有次生构造，未在横切面的显微结构图中发现异常构造。叶上花根的木质部较发达，射线明显。

如图4所示，叶上花根的具体构造如下，周皮为根部最外层，由小于10列的扁平的薄壁细胞连接成环，这些细胞排列规则但不紧密，木栓层存在脱落现象。皮层较窄，由不规则的近圆形的细胞组成。叶上花根的维管束属于无限外韧型。初生韧皮部分化后剩余部分较少，次生韧皮部中的射线在切片中未能表现完全；在薄壁细胞中存在草酸钙结晶。叶上花根的韧皮部、木质部界限明显，即形成层较为明显，由数列近似方形的细胞连接成环状。初生木质部分化至整个根的中心部位，无髓；次生木质部较发达，直径可达900m，可在显微切片图中清楚观察到。以上5部分共同组成一个完整的维管束结构。实验中用盐基品红 龙胆紫染色可将韧皮部染成深蓝紫色，木质部为深红紫色。木质部中导管呈类圆形，且存在木纤维。

图4 叶上花根横切面图（左：100x；右：40x）Fig.4 Root cross section diagrams of Helwingia japonica(Left:100x;Right:40x)

3 结论

通过文献查阅及原植物形态对比观察，初步确定苗族习用药材叶上花来源为山茱萸科青荚叶属的落叶小灌木中华青荚叶[Helwingia japonica(Thunb.)Dietr.]。观察到侧根生长的部位比较靠上，在主茎上接近叶片生长的部位会出现侧根；通过石蜡切片技术对其茎和根的显微结构进行观察，得到茎和根的横切面图。观察显微结构图得知，叶上花茎和根的结构构造正常，主要特点为叶上花茎的薄壁细胞中存在草酸钙方晶，管胞和导管同时存在，且导管多为具缘网纹状，茎的韧皮部射线呈放射状，且十分明显，茎的木质部没有根的木质部发达；根的维管束属于无限外韧型，形成层明显。

4 讨论

目前，国内外前期对青荚叶属植物的研究较少，且主要集中在分离提取化合物方面，对其鉴别方面的研究鲜为报道。本实验为了能更好地解决叶上花品种混乱问题，以叶上花显微鉴定方法为主，对叶上花根与茎两部分进行显微结构特点分析，在一定程度上为叶上花的合理利用提供较为全面的依据。在实验开展过程中，发现叶上花根的木质化现象较严重，侧根和主根的显微结构差异不明显，故选用侧根作为实验材料。此外，在制作叶上花茎的石蜡切片时，选择的材料应避开木质化现象严重的部位，这样不仅便于切片，还有利于观察部位的形态特征。在实验中对染色剂、染色方法和染色顺序等进行改变，其结果并未出现良好的分色现象，尤其是叶上花茎的染色，所以染色方法仍需进一步探究。还需注意的是，本次只是对叶上花的根和茎进行了显微鉴定研究，未来应在此基础上对青荚叶属的5种不同青荚叶的茎、根和叶等分别进行显微鉴定研究，根据显微结构图进行对比，并结合基因组和蛋白组等方面更深入地研究青荚叶属植物，为其进一步开发研究提供依据，进而达到避免基源混乱的目的。