基于网络药理学探究马齿苋与枳椇治疗糖尿病的异同分析

陈成龙，刘兰玲，史继童，颜培正，李佳，赵东升

（山东中医药大学药学院，山东 济南 250355）

糖尿病（diabetes mellitus,DM）是一种伴随因胰岛 素分泌缺陷或生物作用受损引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的异质性疾病[1]，属于中医“消渴”、“消瘅”和“三消”范畴[2]。中国糖尿病患者总数高居世界第一，大约11%的人患有糖尿病[3,4]。中药由于毒性低、副作用小等特点在治疗糖尿病方面有着不可替代的优势。

马齿苋（Purslane oleracea,PO），味酸，对“消渴”病的病机阴虚燥热具有清热解毒、益气生津及散血消肿的作用[5]。枳椇（Hovenia dulcis,HD），味甘、酸，具有清热生津、止渴除烦等作用[6]。性味及功能主治提示两味药均可治疗糖尿病，并已有研究报道证实[7-9]，但其物质基础和潜在机制的异同点尚未得到阐释。

网络药理学是在生物信息学、系统生物学与多向药理学等学科的基础上提出的一种新方法学科，并已在中药物质基础和作用机制研究中广泛应用[10,11]。基于此，我们利用网络药理学技术研究马齿苋、枳椇治疗糖尿病的物质基础及作用机制差异，为进一步深入研究开发和利用药食同源中药治疗糖尿病提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 PO与HD成分靶标汇总

采用ETCM（http://www.tcmip.cn/）、TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库收集PO与HD成分。利用Discovery Studio 2016对符合Lipinski规则的化合物进行药代动力学评价：人类肠道吸收性（HIA）为0或1为优；水溶解度（AS）为3或4。Lipinski规则为分子量（MW）小于500，氢键供体（Hdon）数目小于5，氢键受体（Hacc）数目小于10，脂水分配系数（AlogP）小于5，可旋转键（RK）的数量不超过10。

利用SwissTarget Prediction服务器预测PO与HD成分靶标，UniProt校正名称。以probability＞0为标准收集有效靶点。

1.2 DM基因汇总

以“Diabetes”、“Diabetes Mellitus”为关键词分别在DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）数据库检索疾病基因，并以score＞0.5（DisGeNET）和score＞50（Genecards）为标准筛选有效基因。

1.3 蛋白互作网络（PPI）构建

采用Venny2.1绘制韦恩图获取PO、HD治疗DM共有靶点与特有靶点。运用STRING数据库构建PO与HD调控DM共有靶点和特有靶点PPI网络。Cytoscape3.7.0软件进行PPI网络可视化。

1.4 构建“中药-成分-靶点-疾病”网络

将PO与HD防治DM的共有和特有靶点分别导入Cytoscape3.7.0，构建“中药成分靶点疾病”网络。

1.5 靶点生物功能注释

使用R4.0.3软件，利用Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）的org.Hs.eg.db，colorspace，stringi，DOSE，clusterProfile，pathview，ggplot2和limma等程集包，对筛选的共有和特有靶点进行GO功能和KEGG通路分析（校正P＜0.05）。

2 结果

2.1 基础信息汇总

通过检索数据库得到PO、HD成分分别为58个、45个，经筛选获得PO、HD成分分别为24个、19个（表1），共有成分为芹菜素（apigenin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和杨梅素（myricetin）。Swiss Target Prediction预测靶点数目分别为395个、367个，数据库汇总DM基因856个。将化合物靶点与DM相关基因取交集，得到PO、HD治疗DM的特有靶点分别为42个、34个，共有靶点66个（图1）。

图1 交集靶点韦恩图Fig.1 Intersection targets from the Venn diagram

表1 成分基本信息Table 1 The basic information of components

续表

2.2 关键成分筛选

建立“中药成分靶点疾病”网络（图2），包含182个节点和712条相互关系，平均每个化合物连接14个靶点。通过分析网络拓扑性质，得到网络中起到枢纽作用的化合物。PO中度值较大的成分为5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one、芥子酸（sinapic acid）、木犀草素（luteolin）、咖啡酸（caffeic acid）和HD中为柚皮素（naringenin），共有成分为芹菜素（apigenin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和杨梅素（myricetin），见表2。

图2 “中药-成分-靶点-疾病”网络Fig.2 The network of"Herb-Component-Target-Disease"

表2 关键成分排名（前10）Table 2 The rank of key components(Top 10)

2.3 关键靶点筛选

Cytoscape3.7.0构建药材干预DM的主要作用靶点PPI网络。共有靶点度值排名靠前的为AKT1（44）、EGFR（33）、PTGS2（31）、ESR1（30）、STAT3（26）、CXCL8（27）、PPARG（23）、PIK3CA（21）、IGF1R（19）和SERPINE1（17）（图3 C），在二者防治DM的过程中占主要地位。PO特有靶点排名靠前的为GAPDH（20）、MAPK8（19）、MAPK1（19）和TLR4（10）（图3 A），而HD为VEGFA（16）、ICAM1（9）、MAPK14（9）和HMOX1（8）（图3 B）。

图3 蛋白-蛋白互作网路Fig.3 The PPI network

2.4 靶点生物功能注释

2.4.1 共有靶点共有靶点调控DM涉及1 595条生物过程，与DNA结合、转录因子活性的调控、氧化应激反应RNA分解代谢过程和DNA代谢过程的调控等生物过程有关；涉及134个细胞组分，与黏着、细胞-基底连接等细胞组分有关，涉及162个分子功能，与泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合等分子功能有关（图4 A）。涉及122条通路，主要有PI3K-Akt、糖尿病心肌病、RAGE（糖尿病并发症）、脂质与动脉粥样硬化、cAMP和AMPK等信号通路（图4 B）。

图4 共有靶点生物功能注释Fig.4 The biological function annotation of common targets

2.4.2 PO特有靶点PO特有靶点调控DM涉及1 432条生物过程，与RNA分解代谢过程和DNA结合转录因子活性的调控等生物过程有关；涉及127个细胞组分，与黏着、细胞基底连接等细胞组分有关；涉及154个分子功能，与泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合等分子功能有关（图5 A）；涉及117条通路，主要有PI3K-Akt、糖尿病心肌病、脂质与动脉粥样硬化、甲状腺激素、钙、RAGE（糖尿病并发症）、cAMP、AMPK和Ⅱ型糖尿病等信号通路（图5 B）。

图5 PO特有靶点生物功能注释Fig.5 The biological function annotation of PO specific targets

2.4.3 HD特有靶点HD调控DM涉及547条生物过程，与翻译后蛋白修饰、蛋白质DNA复合物组装等生物过程有关；涉及43个细胞组分，与主轴、黏着等细胞组分有关；涉及55个分子功能，与泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合等分子功能有关（图6 A）；涉及11条通路，有PI3K-Akt、脂质与动脉粥样硬化、Ras、Rap1、MAPK和RAGE（糖尿病并发症）等信号通路（图6 B）。

图6 HD特有靶点生物功能注释Fig.6 The biological function annotation of HD specific targets

3 讨论

《千金要方·食治篇》记载：“知其所犯，以食治之，食疗不愈，然后命药”，且药食同源治疗DM能够平衡各个器官功能，有效控制血糖和预防糖尿病并发症[12]。马齿苋、枳椇被收载于《国家药食同源目录》，药用和食用历史悠久。因此，采用网络药理学技术对二者治疗糖尿病的物质基础及作用机制进行对比，并分析其异同点。

“中药成分靶点疾病”网络显示，PO、HD防治糖尿病的物质基础既存在共同点又具有明显差异。PO与HD共同通过槲皮素、杨梅素等防治DM，此外，PO中的木犀草素、咖啡酸和芥子酸与HD中的柚皮素在防治DM过程中起到非常重要的作用。槲皮素能增加MAPK表达水平而减轻大鼠外周胰岛素抵抗[13]。木犀草素通过抑制大鼠胰腺TLR4表达改善胰岛素抵抗作用[14]。柚皮素能激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路，增强抗氧化反应，减轻糖尿病小鼠心肌损伤[15]。

分析PPI网络发现，PO与HD共有靶点度值排名靠前的靶点居多，有AKT1、PPARG、PIK3CA和SERPINE1等，说明两者除共有成分外，二者的特有成分也能通过作用共同靶点来发挥疗效。分析两味药材的特有靶点，发现HD涉及靶点数目远远少于PO，说明PO发挥疗效的物质基础更广，干预的靶点与通路更多。富集分析结果显示HD和PO集中在糖尿病并发症、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt、cAMP和AMPK等信号通路。胰岛素通过激活PI3K/AKT信号通路，调节血脂和葡萄糖代谢平衡[16]。PPARG的激活使机体外周组织对胰岛素的敏感性增加，抑制肝脏糖异生，脂肪组织脂肪酸分解抑制、合成增加等[17]。PO特异地作用于甲状腺激素、钙和Ⅱ型糖尿病等信号通路，HD特异地作用于Ras、MAPK信号通路。胞内Ca2+浓度升高触发胰腺 细胞分泌胰岛素，Ca2+通道和活性的改变对胞内钙浓度及胰岛素的分泌都起到关键作用[18]。药物干预cAMP信号通路可增加电活动和Ca2+信号，此外，cAMP还有助于胰岛素合成、细胞分化和增殖[19]。

本研究通过共有成分和特有成分的靶点分析，阐释了PO、HD在防治DM方面的物质基础和潜在作用机制差异，为进一步研究开发和利用马齿苋、枳椇资源提供参考，也为深入揭示药食同源中药的药效物质基础和作用机制研究提供一定的理论依据。