白花丹素对肝癌细胞增殖迁移凋亡能力的影响及其作用机制研究

韩淑兰，段昊雨，孙丹丹，宋柳，邹宜芳，初迪，李欢，郭建锋

（吉林大学药学院，吉林 长春 130021）

在过去的几十年中，癌症一直是威胁人类健康和生命的主要杀手。据统计，2018年全球有1 810万癌症新发病例和960万死亡病例，呈逐年上升的趋势[1]。原发性肝细胞癌是中国第四大常见的恶性肿瘤，也是造成肿瘤相关死亡的第二大原因[2]。手术切除部分肝脏并辅以药物治疗是治疗肝癌的首选方案。但由于原发性肝癌的高复发率和高转移率，患者的预后较差，5年生存率低[3]。因此，寻找一种能够有效降低原发性肝癌迁移率和复发率的辅助治疗药物有重要意义。

白花丹素（plumbagin,PLB），又名兰雪醌，是从传统植物药白花丹（Plumbago zeylanica L.）中提取出的萘醌类天然活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和抗炎等多种药理作用[4]。据文献报道，白花丹素对肺癌[5]、胰腺癌[6]、前列腺癌[7]和肝癌[8]等多种癌细胞有明显的抑制作用，然而其对多种肝癌细胞作用的分子途径尚不明确。因此，本研究将白花丹素作用于人源和鼠源两种肝癌细胞，探究其对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响，并揭示其作用分子机制，为白花丹素的临床应用提供理论依据和潜在的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

白花丹素购自上海同田生物技术有限公司；噻唑蓝（MTT溶液，纯度≥98%）购自美国Sigma Aldrich公司；结晶紫染液购自沈阳科托化工有限公司；胎牛血清、胰酶、DMEM培养基和磷酸盐缓冲液均购自美国Thermo Fisher公司；二甲基亚砜（DMSO溶液，纯度≥98%）、甲醇（纯度≥99%）、三羟甲基氨基盐酸盐（Tris）、甘氨酸（Glycine）和Tween 20均购自国药集团化学试剂有限公司；兔抗鼠一抗和羊抗兔二抗购自美国Affinity Biosciences公司；蛋白提取试剂盒和Western Blotting试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；SMMC-7721人肝癌细胞和Hepa 1-6小鼠肝癌细胞属于吉林大学微生物与生物药学教研室；FL600型酶标仪购自美国Bio-Tek公司；FACSCanto流式细胞仪购自美国BD公司；TDZ4-WS低速台式离心机购自长沙湘仪有限公司；GL-8813涡旋混合器购自瑞金仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；Tanon-4500凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；CKX53倒置相差显微镜购自日本奥林巴斯株式会社；Eppendorf移液器购自德国Eppendorf有限公司。

1.2 细胞培养

SMMC-7721人肝癌细胞和Hepa 1-6小鼠肝癌细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃、饱和湿度、5% CO2恒温培养箱中培养，当细胞长至90%时，以1:3的比例进行传代，待细胞处于对数生长期时进行实验。

1.3 MTT法检测白花丹素对肝癌细胞的生长抑制率

分别取对数生长期的SMMC-7721人肝癌细胞和Hepa 1-6小鼠肝癌细胞以1 104个/孔接种于96孔板中，置于恒温细胞培养箱中培育过夜。设置DMSO处理组为对照组、不加药的空白组和不同浓度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L）处理组，每组平行设置4孔，处理24 h，加入MTT 20L，在37℃、5% CO2恒温培养箱中孵育4 h，弃去培养液，加入DMSO150L，避光震荡10 min，待蓝紫色结晶充分溶解后，用酶标仪在570 nm处测量吸光度，并计算细胞存活率和抑制率，实验重复3次。细胞抑制率公式为：

1.4 平板单克隆实验检测细胞增殖活力

分别取对数生长期的SMMC-7721人肝癌细胞和Hepa 1-6小鼠肝癌细胞，以1 103个/孔接种于6孔板中，加入不同浓度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L），以DMSO组为对照组，放入恒温培养箱，培育2周，当6孔板中出现肉眼可见细胞克隆团时停止培养，弃去培养液，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定，加入结晶紫染液染色，显微镜计算细胞克隆数。

1.5 划痕实验检测细胞迁移

分别取对数生长期的SMMC-7721人肝癌细胞和Hepa 1-6小鼠肝癌细胞以1 105个/孔接种于24孔板中，置于恒温培养箱中培育过夜，待细胞长满至90%孔底时，用灭菌的200L移液枪枪头垂直于板，沿预先画好的标记线进行划痕，使用PBS洗涤3次，加入含有2%胎牛血清的DMEM培养液及不同浓度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L），以DMSO组为对照组，放入恒温培养箱。在0 h和48 h拍照，使用Image J软件测量划痕面积并计算划痕愈合率。划痕愈合率计算公式为：

愈合率=（0 h划痕面积48 h划痕面积）/0 h划痕面积100%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡情况

分别取对数生长期的SMMC-7721人肝癌细胞和Hepa 1-6小鼠肝癌细胞以5 105个/孔接种于6孔板中，并放入恒温培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后加入IC50浓度的白花丹素处理12 h和24 h，以DMSO为对照组。用细胞凋亡试剂盒中7-AAD和ANNEXINPE双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率，用FlowJo软件分析数据。

1.7 Western blot检测细胞凋亡通路相关蛋白的表达

分别取对数生长期的SMMC-7721人肝癌细胞和Hepa 1-6小鼠肝癌细胞，加入IC50浓度的白花丹素，处理6 h、12 h和24 h后提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。各组取20L等量蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白条带电转到PVDF膜上，转膜结束后，将PVDF膜以适量的TBST清洗，加入1%封闭液封闭1 h，加入兔抗鼠一抗（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、-actin，比例为1:2 000），4℃孵育过夜，次日早晨用TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗（1:5 000），室温下避光孵育1 h，TBST清洗3次。配制ECL显影液，将PVDF膜浸泡在显影液中孵育1 min，使用化学发光凝胶成像仪对目标蛋白条带进行扫描成像，使用Image J软件计算各组蛋白条带灰度值，计算蛋白条带相对表达量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 白花丹素对细胞生长抑制率的影响

实验结果显示，与DMSO对照组相比，不同浓度白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L）处理24 h后，SMMC-7721生长抑制率分别为（4.27±3.43）%、（14.61±3.8）%、（20.73±6.52）%、（41.31±5.29）%、（61.07±4.86）%和（79.30±7.07）%，IC50为（26.78±6.22）mol/L（图1A）；Hepa 1-6生长抑制率分别为（3.66±3.01）%、（14.17±8.3）%、（22.91±5.2）%、（48.15±6.52）%、（74.67±6.33）%和（87.08±7.56）%。IC50为（21.40±2.52）mol/L（图1 B）。上述结果表明，白花丹素对细胞生长有明显抑制作用（P＜0.05），且呈药物浓度依赖性。

图1 白花丹素对肝癌细胞生长的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of PLB on the viability of hepatoma cells

2.2 白花丹素对细胞增殖能力的影响

分别采用不同浓度白花丹素溶液处理SMMC-7721细胞和Hepa 1-6细胞，在细胞培养箱中培养2周后拍照（图2A），比较集落形成率。如图2B所示，SMMC-7721细胞被不同浓度白花丹素处理后，集落形成数为（320.67±18.52）个、（236.33±20.13）个、（164.33±15.87）个、（115.00±23.69）个、（79.33±15.67）个、（40.67±9.08）个和（23.33±3.08）个；Hepa1-6集落形成数为（361.67±25.88）个、（287.33±32.89）个、（220.67±19.95）个、（143.33±25.67）个、（87.33±15.87）个、（50.00±9.88）个和（23.33±8.31）个。因此，与对照组DMSO相比，药物处理组的集落形成数明显下降（P＜0.05），且随药物浓度的不断增加，集落形成数不断减少，表明白花丹素抑制了SMMC-7721和Hepa1-6细胞的增殖。

图2 不同浓度白花丹素对细胞增殖能力的影响Fig.2 The effect of different concentration of PLB on the cell proliferation

2.3 白花丹素对肝癌细胞迁移率的影响

采用不同浓度白花丹素溶液分别处理SMMC7721细胞和Hepa 1-6细胞，在0 h，48 h进行拍照（图3 A），比较细胞迁移率。如图3 B所示，经过不同浓度白花丹素处理后，SMMC-7721细胞迁移率为（83.01±2.12）%、（75.23±4.32）%、（62.35±3.87）%，（53.67±5.01）%、（14.78±2.13）%、（6.52±1.23）%和（4.71±1.21）%（图3 B）；Hepa1-6细胞迁移率为（80.93±4.67）%、（76.23±4.35）%、（66.56±3.67）%、（52.14±5.23）%、（9.67±4.78）%、（7.96±3.96）%和（5.65±3.80）%（图3 C）。以上结果表明，与对照组DMSO相比，处理组划痕愈合逐渐减少，细胞迁移率显著降低（P<0.05）。因此白花丹素有效抑制SMMC-7721和Hepa 1-6细胞迁移，细胞迁移率随药物处理浓度增加而减少。

图3 白花丹素对细胞迁移率的抑制作用Fig.3 The inhibitory effect of plumbagin on cell mobility

2.4 白花丹素对肝癌细胞凋亡情况的影响

分别采用IC50浓度的白花丹素处理细胞SMMC-7721（26.78mol/L）和Hepa 1-6（21.4mol/L）12 h和24 h，以DMSO组为空白对照组，采用细胞凋亡检测试剂7-AAD和ANNEXIN-PE处理细胞，之后采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况（图4 A）。结果如图4 B所示，在DMSO对照组中，SMMC-7721细胞凋亡率为（2.79±2.38）%，药物处理12 h和24 h后细胞凋亡率分别为（22.16±4.58）%和（54.11±6.96）%。同样，Hepa 1-6细胞对照组凋亡率为（3.76±2.38）%，药物处理12 h和24 h后，细胞凋亡率分别为（20.20±3.05）%和（40.77±5.04）%。两组细胞凋亡结果相似，以上结果显示，与DMSO对照组相比，白花丹素处理组的细胞凋亡率显著增高（P＜0.01），且凋亡率呈时间依赖性。

图4 白花丹素对细胞凋亡率的影响Fig.4 Effect of PLB on apoptosis rate

2.5 白花丹素处理前后细胞凋亡相关蛋白表达变化

分别采用IC50浓度的白花丹素溶液处理细胞SMMC-7721（26.78mol/L）和细胞Hepa1-6（21.4mol/L）6 h，12 h和24 h后提取蛋白，用Western blot法测定各组蛋白表达情况。结果如图5所示，与DMSO对照组相比，处理组Bcl-2表达量在6 h时，与对照组无统计学差异；在12 h和24 h时，Bcl-2表达量显著下降，且与处理时间呈正相关关系（图5 A）；SMMC-7721细胞Bax表达量、Caspase-3和Caspase-9激活量随药物处理时间延长而增加（图5 A），提示在24 h时，SMMC-7721细胞凋亡过程最活跃。如图5 B所示，Hepa 1-6细胞Bax表达量和Caspase-9激活量在处理12h时达到最大值，提示处理12h时，大量Hepa1-6细胞的凋亡通路被激活；Caspase-3激活量随处理时间延长而增加，在24 h到达最大值（图5 B），此时凋亡过程最活跃。

3 讨论

原发性肝细胞癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，尽管多种传统治疗方法已应用于肝癌的临床治疗，但因其高转移率及高复发率，患者常常预后不佳，5年生存率低于40%[9,10]。近年来，中医中药在癌症治疗中发挥了日益显著的作用，中药及其提取物能作用于癌细胞生命周期的多个阶段，具有多靶点、毒副作用小及难产生耐药性的特点[11]。白花丹素是我国传统中药白花丹的根部提取物，属于天然有效活性成分，研究表明，白花丹素具有一定的抑制癌细胞增殖的作用[5-7]，是一种潜在的抗癌药物。然而，肝癌发病机制不一、癌细胞类型复杂多样，虽有报道称白花丹素通过抑制基质蛋白酶产生抑制HepG2肝癌细胞迁移[8]，但白花丹素对多种肝癌细胞的抗癌作用机制目前尚不明确，阻碍了其临床广泛应用。因此，深入研究白花丹素对多种肝癌细胞的作用效果及机制，对于进一步阐明并推动白花丹素的临床抗肝癌应用具有重要的意义。本研究系统探究了白花丹素对两种肝癌细胞（SMMC-7721和Hepa 1-6）增殖、迁移与凋亡的影响及其作用机制。

MTT实验与平板单克隆形成实验结果显示，白花丹素对肝癌细胞生长和集落形成能力与药物浓度呈正相关关系，说明白花丹素在体外有较强的抑制肝癌细胞增殖的能力。肝癌患者预后较差的重要原因之一就是癌细胞易发生侵袭和转移。因此，降低肝癌细胞的迁移能力，是预防其侵袭和转移的有效手段。在本研究中，划痕实验结果显示，白花丹素能有效抑制肝癌细胞的迁移能力，且迁移率随药物浓度升高而降低，迁移率最终降低至4.71%±1.21%（SMCC-7721）和5.65%±3.80%（Hepa 1-6），说明白花丹素在体外有较强的抑制肝癌细胞迁移的能力。

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，当细胞所处的环境发生变化，如接触化学药物时，凋亡通路被激活，出现细胞凋亡[12,13]。有研究表明，药物可通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡[14,15]，而线粒体介导的凋亡途径主要依赖Bcl-2家族蛋白调控，其中包括凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡诱导蛋白Bax[16-18]。当外源刺激激活Bax蛋白时，Bax作用于线粒体外膜，引起线粒体外膜通透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP），线粒体膜间隙的细胞色素C（cytochrome C）释放进入胞质，促使Caspase-3和Caspase-9激活[19,20]，激活的Caspase-9（Cleaved-Caspase-9）切割凋亡执行蛋白Caspase-3，然后，活化的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）使聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）裂解，最终导致细胞凋亡[21]，而抑制凋亡蛋白包括Bcl-2，能够抑制MOMP作用，从而阻止这个过程[22]。本研究结果显示，白花丹素上调了Bax蛋白表达水平，下调了Bcl-2蛋白表达水平；活化的Caspase蛋白与未活化的Caspase的比值随处理时间延长而升高，表明Caspase-3和Caspase-9被激活，且激活程度与处理时间呈正相关关系，说明白花丹素在体外有较强的诱导细胞凋亡的能力，其诱导细胞凋亡的作用机制与内源性线粒体凋亡途径密切相关。

综上所述，白花丹素可抑制肝癌细胞的增殖与迁移，并有效诱导细胞凋亡，且呈剂量-时间依赖性，同时，白花丹素可下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平，上调凋亡相关蛋白Bax的表达，并促进凋亡执行蛋白Caspase-3的激活以促进细胞凋亡，因此，白花丹素具备成为有效治疗肝细胞癌的药物的潜能。本研究为白花丹素的临床抗肝癌应用提供了理论基础和实验依据。